靶向PCSK9，怕打针？反义寡核苷酸或可实现口服给药

撰文丨咸姐

责编丨翊竑

PCSK9（Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员）是一种参与调节肝脏低密度脂蛋白（LDL）受体生命周期的分泌性蛋白。PCSK9可以与LDL受体的胞外结构域结合，靶向该受体进行核内体降解，阻止LDL颗粒内化后再循环到肝细胞表面【1】。研究发现，人类PCSK9的功能获得性突变与家族性显性高胆固醇血症有关，而其功能丧失性突变则可导致LDL胆固醇浓度降低并预防冠状动脉疾病的发生【2, 3】，这使得抑制PSCK9成为治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的一种极具吸引力的靶向疗法。

目前针对PSCK9的抑制主要有两类，一类是使用单克隆抗体（mAb），其可抑制循环中的PCSK9，从而降低LDL胆固醇水平，这一治疗策略被证明对心血管疾病患者有疗效；另一类是通过小干扰RNA（siRNA）抑制PCSK9的 mRNA使其发生基因沉默，该方法最近已申请上市批准，并且其在降低血浆LDL胆固醇已展现出显著效果【4, 5】。但是，现阶段的治疗性PCSK9抑制剂都需要通过注射给药，这无疑给患者带来了诸多不便与痛苦，一种替代性的、更方便、无创的给药途径成为亟需解决的临床需求，以提高患者的依从性和治疗效果。

近日，来自瑞典阿斯利康制药公司的Peter Gennemark团队在Science Translational Medicine上发表题为 An oral antisense oligonucleotide for PCSK9 inhibition 的研究文章，开发了一种靶向PCSK9以调节LDL受体的反义寡核苷酸（ASO），其可以口服给药，并被肝脏吸收。皮下注射此ASO对PCSK9过表达的小鼠显示出很强的有效性，其在猴子肝脏中的半衰期为18天，并且可以有效减少人体循环中的PCSK9水平。同时，大鼠和犬类实验结果显示，与皮下注射相比，该ASO口服制剂的肝脏生物利用度为5%-7%，并且能降低健康猴子的LDL胆固醇。由此表明该ASO可以在避免注射的同时，具有抑制PCSK9的潜力。

本文研究人员开发出一种具有限制性乙基（cEt）化学修饰的强效16-核苷酸寡聚物，三触角型N-乙酰半乳糖胺（triantennary N-acetylgalactosamine，GalNAc）反义寡核苷酸——AZD8233（也称为ION-863633），旨在靶向PCSK9 mRNA，从而抑制细胞内蛋白翻译和PCSK9蛋白合成。当AZD8233给药被肝细胞摄取后，GalNAc将被切割，没有GalNAc部分的AZD8233即为母药，称为非偶联AZD8233（也称为ION-848833）。

首先，研究人员对过表达了人PSCK9的转基因小鼠进行每周皮下注射AZD8233，为期4周，以评估AZD8233的药效。结果显示AZD8233的肝脏暴露呈剂量依赖性增加，伴随着人血浆PCSK9和LDL胆固醇的剂量依赖性降低，并且与非偶联的母药ASO直接给药相比，AZD8233的药效增加了近10倍。随后，研究人员对野生型小鼠进行皮下给药后探究靶向PCSK9转录本的GalNAc ASO能在多大程度上降低相关的血脂异常生物标记物。结果显示，靶向小鼠PCSK9转录本的GalNAc ASO（ION-866672）可以有效降低小鼠血浆PSCK9蛋白浓度，诱导肝脏LDLR表达，从而降低血浆总胆固醇和LDL胆固醇浓度。

进一步地，研究人员在食蟹猕猴体内研究AZD8233的药代动力学（PK），每月皮下注射4次，并第一次给药后1周额外给药一次。结果发现AZD8233表现出非线性PK，最大肝脏浓度随剂量的增加不成比例地增加。而非偶联AZD8233的肝脏半衰期为数周，并且AZD8233的肝脏暴露浓度符合预期。此外，研究证实，在人体LDL胆固醇基线浓度为134±3.9 mg/dl时，单次皮下注射AZD8233（12、30和90 mg）可显著降低血浆PCSK9蛋白浓度，且呈剂量依赖性，而在剂量随访期后的16周内，PCSK9和LDL胆固醇均缓慢恢复至基线水平或接近基线水平。

为了研究AZD8233口服给药的潜力，研究人员采用经空肠（IJ，此模型可模拟口服片剂）和皮下单剂量给药对空肠插管大鼠的肝脏生物利用度进行了量化。在所需的肝脏浓度为4 μg/g、且转基因小鼠的数据预计会导致PCSK9减少80%时，与皮下注射AZD8233相比，IJ的肝脏生物利用度为5.3%。与此同时，研究人员给比格犬每天口服AZD8233片剂，持续7天或28天，测量血浆和肝脏暴露。随着时间的推移，未偶联的AZD8233在肝脏中积累，肝脏的生物利用度为5%，是血浆生物利用度的5倍，提示AZD8233在肝脏被积极吸收。此外，研究人员将含有增强剂的大鼠特异性替代ASO溶液对大鼠进行IJ给药，以及给予食蟹猕猴口服片剂后，观察到血浆中PCSK9和LDL胆固醇都显著降低，由此进一步证明了口服给药的靶向作用。最后，基于人体口服给药后肝脏生物利用度为5%的假设，与每月皮下注射一次（25mg/月）AZD8233相比，研究人员预测每日15mg的口服剂量将使循环PCSK9在稳定状态下减少80%，从而支持了用于口服治疗血脂异常的化合物的开发。

综上所述，本研究提出了一种具有口服给药潜力的有效的PCSK9抑制剂——GalNAc偶联ASO（AZD8233），其口服给药潜力主要源于两个重要特性：第一，由于cEt化学修饰和GalNAc的偶联使得AZD8233具有肝细胞靶向性，使得其给药剂量减少，有效性增强；第二，AZD8233的肝脏半衰期可达数周，从而使得其在每天重复给药一次后随时间在肝脏中累积。本研究不仅揭示了AZD8233皮下给药后的药代动力学和药效学特征，证明其在动物和人体内的高药效，而且还在大鼠、犬、猕猴的一系列实验中探讨了AZD8233口服给药的可行性，由此支持AZD8233作为口服剂型的发展，并显示了ASO口服给药的潜力。

原文链接：

https://stm.sciencemag.org/content/13/593/eabe9117

参考文献

1. C. N. Hess, C. C. Low Wang, W. R. Hiatt, PCSK9 inhibitors: Mechanisms of action, metabolic effects, and clinical outcomes. Annu. Rev. Med. 69, 133–145 (2018).

2. P. El Khoury, S. Elbitar, Y. Ghaleb et al. PCSK9 mutations in familial hypercholesterolemia: From a groundbreaking discovery to anti-PCSK9 therapies.Curr. Atheroscler. Rep. 19, 49 (2017).

3. J. C. Cohen, E. Boerwinkle, T. H. Mosley Jr. et al. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. N. Engl. J. Med. 354, 1264–1272(2006).

4. M. S. Sabatine, PCSK9 inhibitors: Clinical evidence and implementation. Nat. Rev. Cardiol. 16, 155–165 (2018).

5. K. K. Ray, R. S. Wright, D. Kallend et al. ORION-10 and ORION-11 Investigators, Two phase 3 trials of inclisiran in patients with elevated LDL cholesterol. N. Engl. J. Med. 382, 1507–1519 (2020).