肿瘤治疗新靶点：由DHODH介导的位于线粒体中的铁死亡防御系统

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铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式 (regulated cell death)，为脂质过氧化物 (lipid peroxidation)的过度积累所导致。其特征是细胞的抗氧化防御系统 (cellular antioxidant defense system) 失活后, 导致细胞膜上含不饱和脂肪酸长链的磷脂分子(polyunsaturated-fatty-acid–containing phospholipids, or PUFA-PLs）被过氧化, 进而破坏细胞膜的完整性而导致铁死亡【1-3】。细胞最经典的铁死亡防御途径为谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4 or GPX4）通过谷胱甘肽（glutathione or GSH）依赖的方式特异性催化脂质过氧化物使其失去氧化活性，进而保护细胞免受铁死亡威胁【4,5】。新近研究发现FSP1是一种GSH非依赖性铁死亡抑制因子， 其在细胞膜上能够通过还原泛醌（ubiquinone, or CoQ）为二氢泛醌 (ubiquinol, or CoQH2), 并由后者作为一种自由基捕获抗氧化剂 (radical trapping antioxidant) 在细胞膜上来阻止脂质过氧化，从而抑制铁死亡发生（Nature背靠背 | 铁死亡调控新途径）。然而，细胞是否在其它细胞器膜里也存在铁死亡防御系统参与调控铁死亡仍未可知。

2021年5月12日，来自美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心的甘波谊教授团队在 Nature发表题为DHODH-mediated ferroptosis defence is a targetable vulnerability in cancer的长文 (Article)， 首次发现位于线粒体中的铁死亡防御系统可以通过不依赖于GSH途径调控铁死亡的新机制（甘波谊教授为通讯作者，毛超博士为第一作者）。

具体来说, 线粒体是存在于真核细胞中由两层膜包被的细胞器，是制造能量和进行有氧呼吸的主要场所。线粒体作为细胞的“动力源”，在氧化磷酸化过程中位于内膜的电子传递链产生大量活性氧（reactive oxygen species, orROS），当线粒体抗氧化系统损害而无法清除ROS时，脂质过氧化随之发生【6】。二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase orDHODH）是定位于线粒体内膜的黄素依赖酶，其主要功能是催化嘧啶核苷酸合成（pyrimidine biosynthesis）途径的第四步反应，即将二氢乳清酸(dihydroorotate or DHO) 氧化为乳清酸 (orotate or OA)，与此同时将电子传递给线粒体内膜中的泛醌，使其被还原成为二氢泛醌【7】。这篇文章发现DHODH通过调控线粒体内膜中的二氢泛醌生成进而在线粒体中抵抗铁死亡发生。这项工作对于将铁死亡应用于肿瘤治疗也有重大意义。值得一提的是, 甘教授团队近年已在Nature Cell Biology， Nature Communications，Cell Research以通讯作者发表多篇论文阐述铁死亡和肿瘤发生及治疗的关系（『珍藏版』综述 | 甘波谊团队全面分析SLC7A11/xCT在癌症中的作用——铁死亡，营养依赖，肿瘤治疗；『珍藏版』综述 | 铁死亡，放疗，以及联合治疗策略；NCB | 甘波谊等揭示AMPK可抑制铁死亡 ）【8-13】。

为了研究铁死亡过程中细胞内代谢物的变化，甘教授实验室的毛超博士等使用GPX4抑制剂 (比如RSL3) 处理细胞后，采用非靶向代谢组学分析, 发现N-氨基甲酰基-天冬氨酸（C-Asp）含量显著下降，尿苷（Uridine）含量显著上升，同位素示踪实验也进一步证实, 在GPX4抑制剂处理后, 尿苷5'-单磷酸酯 (uridine 5'-monophosphate or UMP) 合成显著上升。这提示铁死亡和嘧啶核苷酸合成可能存在关系。通过补充嘧啶合成中间代谢物, 作者发现二氢乳清酸抑制RSL3诱导的铁死亡，而乳清酸使细胞对RSL3更为敏感，且此现象在GPX4低表达细胞系中更为明显。由于二氢乳清酸和乳清酸分别是DHODH的底物和产物, 这进一步提示DHODH可能参与调控铁死亡。进一步实验显示RSL3处理后DHODH的酶活性也显著上升。

进一步研究发现使用DHODH抑制剂Brequinar（BQR）在GPX4低表达细胞中能够诱导铁死亡发生。而在GPX4高表达的细胞中，BQR处理能够显著增加细胞对于铁死亡诱导剂的敏感性。CTRP (Cancer Therapeutics Response Portal) 数据库显示DHODH表达水平与GPX4抑制剂的耐药性呈正相关。在GPX4高表达细胞系中敲除DHODH使细胞对RSL3诱导的铁死亡更为敏感，而在GPX4低表达细胞系中，敲除DHODH会直接导致脂质过氧化及铁死亡的发生。在GPX4高表达细胞系中敲低GPX4表达使细胞对DHODH抑制剂诱导的铁死亡更为敏感，且在GPX4敲低细胞系中进一步敲除DHODH会直接诱导脂质过氧化和铁死亡的发生。

作者随后发现, 在DHODH敲除细胞中重新表达野生型DHODH，而不是其催化失活突变体或线粒体定位信号缺失突变体, 能够增加其对GPX4抑制剂的抵抗。哺乳动物细胞中具有几种独特亚细胞定位的GPX4，其中主要包括细胞浆和线粒体定位的GPX4。在GPX4敲降细胞中过表达线粒体GPX4, 而不是胞浆GPX4, 能够使细胞对于DHODH抑制剂诱导的铁死亡更为抵抗。另外, 在野生型细胞中过表达FSP1显著增加细胞对GPX4抑制剂的抵抗, 但在DHODH敲除细胞中过表达FSP1却不影响细胞对于GPX4抑制剂的敏感性。进一步研究发现DHODH和线粒体GPX4的共同失活, 而不是单独失活, 能够显著增加线粒体中的脂质过氧化, 而且这种线粒体脂质过氧化不受胞浆GPX4或FSP1调控。BQR处理能够显著升高CoQ/CoQH2比例，且定位于线粒体的抗氧化剂MitoTEMPO或MitoQH2能够显著抑制DHODH敲除细胞中GPX4抑制剂引起的铁死亡, 但是对GPX4抑制剂在野生型细胞中引起的铁死亡抑制效果有限。这一系列实验提示DHODH在线粒体内膜中通过将泛醌还原成为二氢泛醌, 和线粒体GPX4协同在线粒体中抑制脂质过氧化和铁死亡。这个位于线粒体中的铁死亡防御系统和胞浆GPX4以及FSP1组成的在细胞膜上铁死亡防御系统是两套不同的体系。

以上研究揭示DHODH可以抑制线粒体中的脂质过氧化和铁死亡的发生, 而且这个作用在GPX4低表达条件下尤为重要, 这也提示GPX4低表达肿瘤可能对DHODH抑制剂更加敏感。在进一步研究中, 裸鼠成瘤和人源肿瘤异种移植（patient-derived xenografts, or PDX）模型均证实DHODH抑制剂在GPX4低表达 (而不是GPX4高表达) 的实体瘤中能够诱导肿瘤中的铁死亡发生并明显抑制肿瘤生长，并且, 在GPX4高表达的实体瘤中联合铁死亡诱导剂 sulfasalazine与DHODH抑制剂能够有良好的治疗效果。这一发现对于在癌症治疗中如何靶向铁死亡提供了新的策略。

总的来说，本研究鉴定出独立于经典的GPX4信号通路的铁死亡抑制因子DHODH，并首次发现基于线粒体脂质过氧化的铁死亡方式。这篇文章和最近的FSP1文章遥相呼应（详见BioArt报道：Nature背靠背 | 铁死亡调控新途径）, 提出 DHODH, FSP1和GPX4在细胞中形成三足鼎立之势来共同防御铁死亡。具体来说, 细胞中至少存在三种基于不同亚细胞定位的铁死亡防御系统(见下图)：胞浆和线粒体中的GPX4，细胞膜上的FSP1, 和线粒体中的DHODH；其中DHODH和线粒体GPX4构成了线粒体中的主要防御体系。这和部队在一场战役中要在不同的战场设置多重防线是一个道理。而GPX4作为细胞中防御铁死亡的最精锐部队, 可以游走于不同的战场 (胞浆和线粒体) 参与防御。但当这个王牌军团兵力不足之时 (比如在GPX4低表达或者敲低细胞中, 或者在GPX4抑制剂处理条件下, 细胞不得不依赖于DHODH在线粒体中防御铁死亡并为其提供大量弹药 ，体现为在GPX4抑制剂处理条件下, UMP合成增加和DHODH酶活性上升), 但这也导致GPX4低表达肿瘤对DHODH抑制剂更加敏感。这一重要发现从而对于癌症中铁死亡相关药物开发等方面提供了重要的策略参考。

通讯作者和第一作者简介：

论文通讯作者甘波谊教授任职于美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心，长期从事肿瘤代谢、铁死亡、肿瘤治疗等方向研究 (https://www.mdanderson.org/research/departments-labs-institutes/labs/gan-laboratory.html)，在Nature、Cancer Cell、Nature Cell Biology、Nature Communications、PNAS、Cell Research等杂志发表文章60多篇，引用14,000次。主持NIH、CPRIT等机构的多个研究项目，担任众多国际知名学术期刊评委。甘波谊教授团队近年在国际知名杂志, 如Nature, Nature Cell Biology, Cell Research, Nature Communications, 以通讯作者发表多篇论文阐述铁死亡和胱氨酸代谢与肿瘤发生及治疗的关系【8-13】。实验室欢迎对铁死亡和肿瘤代谢及其应用研究感兴趣的博士后、研究生加入。通讯邮箱：bgan@mdanderson.org 。

论文第一作者毛超博士， 2018年获中南大学博士学位，2019年至今在MD Anderson Cancer Center 甘波谊教授实验室从事博士后研究。毛博士以第一作者在Nature，Cancer Research，Cell Death & Differentiation等期刊发表文章多篇，并获得Jeffrey Lee Cousins Fellowship等奖项。

甘波谊团队近期部分工作：

1. 『珍藏版』综述 | 铁死亡，放疗，以及联合治疗策略
2. Nature Cell Biology丨甘波谊/李蔚合作组揭示铁死亡在抑制肿瘤中的重要意义
3. Cell Research | 甘波谊/王晖团队揭示放疗通过诱导铁死亡杀伤肿瘤
4. NCB | 甘波谊等揭示AMPK可抑制铁死亡
5. 『珍藏版』综述 | 甘波谊团队全面分析SLC7A11/xCT在癌症中的作用——铁死亡，营养依赖，肿瘤治疗
6. Nat Comm | 甘波谊团队报道Cyst(e)ine调控铁死亡的新机制

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03539-7

参考文献

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