Nature Genetics 背靠背 | 黑麦基因组高质量精细物理图谱发布，助力麦类作物遗传育种改良创新

2021年3月18日，河南农业大学农学院植物基因组学与分子育种中心杨建平和王道文研究员，联合河南农业大学农学院杨青华教授课题组、北京大学现代农业研究院邓兴旺院士团队何航研究员课题组、四川农业大学任天恒副教授课题组及百迈客生物科技公司在国际遗传学主流刊物Nature Genetics上发表了题为A high-quality genome assembly highlights rye genomic characteristics and agronomically important genes的研究论文，解决了长期以来悬而未决的黑麦基因组精细物理图谱组装难题，完成了中国栽培种“威宁黑麦”的基因组组装和解析，并揭示了黑麦基因组结构与演化的独特性及其淀粉合成、储存蛋白、抽穗期及驯化等相关基因的基因组特征。Nature Genetics同期也发表了德国莱布尼茨植物遗传与作物研究所Nils Stein教授课题组题为Chromosome-scale genome assembly provides insights into rye biology, evolution, and agronomic potential的研究成果，发布了欧洲栽培黑麦“Lo7”的基因组组装结果，解析了黑麦基因组的演化特征及其抗病、抗冷与自交不亲和等生物学过程的发生与作用机制，揭示了黑麦易位染色体片段对小麦遗传改良的重要作用。这些研究成果对黑麦、小黑麦以及小麦遗传改良的基础与应用研究具有重要参考价值和指导作用，同时也为麦类作物育种的源头创新提供了许多新颖的信息资源。

黑麦 （Secale cereale） 是禾本科小麦族黑麦属二倍体植物，是小麦、大麦和燕麦等其他麦类作物的近缘物种。黑麦具有突出的抗寒、抗病、抗逆和耐旱能力，对贫瘠生存环境有很强的适应能力，可耐受其他谷物无法耐受的极端气候条件，对肥料及农药需求较少，种植黑麦可给自然条件恶劣地区带来显著生态和经济效益。黑麦在欧洲至少已有7000年栽培历史，至今依然是北欧地区的主要粮食和饲料作物之一，黑麦在我国西北、东北和西南山区也有种植 【1】 。在全球范围内，黑麦每年有412万公顷的种植面积，产量约为1120万吨，其中欧洲占全球黑麦产量的80% （图1） 。

图1. 全球黑麦产量分布图。

俄罗斯著名的含酒精饮料格瓦斯和大列巴面包 （俄语黑麦面包хлеб的音译名字） 都是以黑麦为主要原料制作而成。写进高中生物教材的“小黑麦”，是由二粒小麦 （AABB） 或普通小麦 （AABBDD） 和黑麦 （RR） 远缘杂交人工合成的异源六倍体或八倍体新物种。通过远缘杂交，黑麦染色体还能部分地替换掉小麦的染色体片段，产生稳定遗传的小麦品系，为小麦育种导入优异外源基因。由黑麦和小麦远缘杂交产生的1BL/1RS易位系，能显著提高小麦的抗病性和产量，为保障我国和世界小麦生产以及粮食安全起到了至关重要的作用。据研究，在我国栽培的冬小麦品种中，50%以上都携带有1BL/1RS易位染色体，该类品种在北方冬麦区和黄淮冬麦区中占据主导地位 【2】 。

高质量参考基因组序列是生物学功能研究的基础。相对于其他二倍体麦类基因组，黑麦基因组 （2n = 2x = 14, RR） 更加复杂。前期研究表明黑麦基因组大小为~8 Gb，远大于水稻（25倍）、谷子 （20倍） ，高粱 （11倍） 、玉米 （4倍） 、大麦 （1.5倍） 等其他谷物基因组、其基因组中有超过90%的序列由高度重复的转座子 （TE） 序列组成。自然情况下黑麦是异交作物，具有自交不亲和性，其基因组有很高的杂合度。以上这些复杂性是国际上长期以来无法获得黑麦基因组高质量精细物理图谱的主要障碍，这严重限制了黑麦重要农艺性状遗传基础的解析和禾本科作物比较基因组学研究的深入开展，对黑麦、小黑麦和小麦等重要作物遗传育种改良研究也十分不利。

为了解决上述科学问题，河南农业大学农学院联合四川农业大学、北京大学和百迈客生物科技公司等多家单位组建了协同创新研究团队，利用中国栽培品种“威宁黑麦”严格自交可结实的特性，得到了高度纯合的材料，运用高通量二代测序、PacBio单分子测序、染色质三维构象捕获 (Hi-C) 、 单分子光学图谱 （Bionano） 和高密度遗传图谱等技术，联合优化多种组装策略，成功构建了威宁黑麦基因组的高质量精细物理图谱 （图2） 。

图2. 威宁黑麦基因组的重要特征。（A）染色体与着丝粒 (红色标注)，（B）转座子 (TE) 密度，（C）基因密度，（D, E）Gypsy （D）和Copia （E）反转录转座子密度， （F）GC含量，（G）基因组内同源区段。

威宁黑麦基因组组装大小为7.84 Gb，其中93.67%的序列可以锚定到7条染色体上，有5条染色体大小超过了1 Gb，最大的染色体长度 （2R） 为1.15 Gb，其大小为水稻整个基因组的3.6倍。威宁黑麦中一共注释到了45596个高可信度基因，这些基因中有1989个抗病基因。分析发现，黑麦中有6.99 Gb的TE序列，占基因组比例的90.31%，显著高于其他麦类作物。长末端重复反转录转座子 （LTR-RT） 对黑麦基因组扩张贡献最大，相对于大麦，黑麦多出2.52 Gb的LTR-RT序列，贡献了基因组扩张的85.42%。黑麦中LTR有两次明显的活跃复制时间，一次大约发生在170万年前，与大麦TE扩张时间相近；最近的一次大约发生在50万年前。研究人员重新构建了禾本科系统演化史，发现黑麦与小麦共同祖先的分化时间大致在960万年前 （图3a） 。以水稻和小麦为参考，进行比较基因组学分析发现，黑麦基因组结构变异频繁，存在很多特异的染色体重排和大片段易位事件 （图3b） 。本研究得到的黑麦高质量精细基因组物理图谱，是已知组装完成的最复杂的二倍体禾本科物种基因组。黑麦基因组高质量精细物理图谱的获得，填补了禾本科物种基因组信息的重要空缺，为作物基因组学研究和重要农艺性状功能解析提供了非常珍贵的信息资源。

图3. 黑麦基因组演化分析（a）以及黑麦与水稻（b）和小麦（c）基因组的共线性分析。

庞大的基因组往往伴随着复杂的基因复制现象。本研究在威宁黑麦基因组中鉴定到了大量复制基因，并解析了它们的复制类型 （图4a） 。在黑麦淀粉合成通路相关基因 （SBRG） 中，分别发生了5次转座复制、1次串联复制、1次分散复制和两次近距离复制事件；尤其是ScSuSy2两个复制基因之间的表达谱发生了明显差异，预示着它们可能产生了新的功能分化 （图4d） 。这一发现说明基因复制为黑麦基因功能分化提供了新的可能，并为黑麦的适应性演化提供了遗传多样性基础。

图4. 黑麦的基因复制及其对SBRG多样性的影响。

种子储存蛋白 （SSP） 对麦类作物食用和加工品质具有决定性的影响。黑麦中一共有四个SSP位点 （Sec1 - Sec4） 。SSP位点一般包含多个高度相似的串联重复基因，导致其难以组装出完整序列，这对研究造成了很大困难。利用威宁黑麦基因组精细物理图谱，结合三代全长转录组数据，成功实现了对这些复杂位点的组装，并详细解析了这些复杂位点的组成和结构特点 （图5a） 。前人研究认为2R上的Sec-2位点可能是由6R上的Gli-2同源位点易位而来，而利用威宁黑麦高质量物理图谱进行共线性分析却发现，6R上不存在Gli-2同源片段，黑麦的Sec-2位点除了插入的三个串联重复75k -黑麦碱基因外，这一区域与其他麦类作物第三同源群的一个区段保持了很好的共线性 （图5b） ，分析也发现黑麦Sec-1位点上缺少了与小麦低分子量谷蛋白对应的基因座位。这些结果明晰了黑麦四个SSP位点的基因组成和结构特征，为黑麦、小黑麦以及小麦品质改良提供了有益而详实的信息。

图5. 威宁黑麦SSP位点的结构特征（a）与共线性分析（b）。

抽穗期是影响作物适应性和产量的关键农艺性状。在两个中国栽培黑麦品种中，相对于荆州黑麦，威宁黑麦在长日照条件下抽穗期提早10-12天；与此相应，威宁黑麦中顶端分生组织的发育进程明显加快，促进开花的成花素基因ScFT也会提前表达 （图6a、b和c） 。生化试验发现ScFT蛋白检测的分子量 （29 kDa） 大于其理论预测值 （19 kDa） ，推测其可能存在翻译后磷酸化修饰现象，随后的磷酸化蛋白检测试验证实了这一假设 （图6d和g） 。研究者进一步对植物FT蛋白中两个保守的磷酸化位点进行了模拟磷酸化 （S76D, T132D） 和模拟去磷酸化 （S76A, T132A） 突变，烟草表达试验发现S76D、T132D及其双突变大幅度降低了ScFT的稳定性与促进植株开花的功能，而S76A、T132A及其双突变可增强ScFT的稳定性及促进植株开花的功能 （图6e、f和g）。这些发现为未来进一步改良黑麦的抽穗期、生态适应性以及产量潜力具有指导作用和实用价值。

图6. 威宁黑麦早抽穗期相关基因的表达特征分析。

前人研究发现栽培黑麦是从野生种瓦维洛夫黑麦 （S. cereale subsp. vavilovii） 中驯化而来，但其驯化的遗传机制仍不清楚。以威宁黑麦高质量参考基因组为基础，研究人员利用已有的101份黑麦自然群体材料测序数据 【1】 ，鉴定了黑麦全基因组中可能的驯化选择位点 （图7a） ，分析发现这些驯化选择区域中包含了已知的驯化基因或重要农艺性状基因的同源基因，比如ScBC1、ScBtr、ScGW2、ScMOC1、ScID1 和 ScWx等。ID1在水稻和玉米中已被证实和抽穗期相关，可促进植物从营养生长到生殖生长转换。研究者发现三种分析方法 （DRI、F ST ，和XP-CLR） 均能在黑麦ScID1位点所在染色体区段鉴定到显著的选择信号。进一步分析发现ScID1在黑麦中发生了一次独特的串联重复，而其他近缘小麦物种中仅存在一个ID1同源基因 （图7d） 。利用威宁与荆州黑麦F 2 遗传群体的抽穗期数据，证实了ScID1确实能影响黑麦抽穗期表型变异，来自威宁黑麦的ScID1 WN 等位基因能促进黑麦提前抽穗 （图7f） 。以上这些结果说明ScID1在黑麦驯化历史中有可能发挥了重要作用，这对黑麦驯化遗传基础的进一步解析具有指导意义。

图7. 栽培黑麦驯化相关染色体位点的全基因组扫描与ScID1的遗传分析。

总之，研究人员克服了复杂基因组组装的多重障碍，成功绘制了威宁黑麦基因组的高质量精细物理图谱，完成了黑麦基因组结构与功能的深度解析，填补了作物基因组学研究的一个重要缺失环节，为黑麦驯化以及禾本科植物基因组的演化与比较基因组学研究提供了重要资源，其结果也将显著促进黑麦、小黑麦、小麦等相关麦类作物的遗传育种改良创新。

河南农业大学李广伟博士、王立建博士、杨建平研究员和靳怀冰博士以及北京大学现代农业研究院何航研究员、百迈客生物科技公司李绪明和四川农业大学任天恒副教授为论文的共同第一作者。杨青华教授、杨建平研究员、张坤普副研究员和王道文研究员为论文的共同通讯作者。北京大学韩雪、河南农业大学郑楠楠、王钊辉、张梦兰、孙广华、杨书玲、师翠兰、熊子君、苟明月和郑旭、遗传发育所赵晓歌、李峰、董玲丽和李义文以及四川农业大学任正隆、颜泽洪和宋中平也参与了该项研究。德国莱布尼茨植物遗传与作物研究所Nils Stein教授、捷克生物技术与农业研究中心Jaroslav Doležel教授以及北京大学现代农业研究院邓兴旺教授对项目开展提供了重要指导。威宁黑麦基因组研究得到了科技部国家重点研发计划 （2016YFD0100500） 、国家自然科学基金 （91935304） 、河南省粮食作物协同创新中心建设经费、河南省中原博新人才计划 （李广伟） 和全球可持续发展植物工具开发 （J. Doležel） 等项目的支持。

参考文献：

1. Schreiber, M., Himmelbach, A., Börner, A. and Mascher, M. Genetic diversity and relationship between domesticated rye and its wild relatives as revealed through genotyping-by-sequencing. Evol. Appl. 12, 66-77 (2019).

2. 周阳, 何中虎, 张改生, 夏兰琴, 陈新民, 高永超, 井赵斌, 于广军. 1BL/1RS易位系在我国小麦育种中的应用. 作物学报, 531-535 (2004).

https://www.nature.com/articles/s41588-021-00808-z

https://www.nature.com/articles/s41588-021-00807-0