肝脏疾病动物模型之——小鼠四氯化碳肝损伤模型

引言：四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4 )诱导的肝损伤模型由于其操作简单，重复性高，广泛被用于肝坏死及肝硬化的病因学、组织学和肝功能变化的研究以及对保肝药物、药用植物提取物的评价。

为了使广大的科研工作者对小鼠四氯化碳肝损伤模型有更深的了解，提高科研效率，在这篇文章中，将小鼠四氯化碳肝损伤模型的致病机制、特点、诱导操作方法及优缺点进行了汇总，希望能够为广大科研人员带来些许帮助。

四氯化碳的致病机制

CCl4在肝脏中由细胞色素P450超家族的单加氧酶（CYP家族）代谢为三氯甲基自由基（CCl3*）。随后，这种自由基与核酸、蛋白质和脂质发生反应，从而损害关键的细胞过程，导致脂质代谢改变（脂肪变性和脂肪变性）和蛋白质含量降低。

CCl 3 *和DNA之间的加合物形成进一步触发突变和HCC的形成。CCl 3 *氧化产生的三氯甲基过氧自由基（CCl 3 OO*）进一步引发脂质过氧化和多不饱和脂肪酸的破坏。因此，所有细胞室（线粒体、内质网和质膜）的膜通透性降低，出现以炎症、纤维化、肝硬化和肝癌为特征的全身性肝损伤。

小鼠四氯化碳模型的特点

CCl4的急性毒性已在许多动物实验中得到证实。单次口服溶解CCl4的玉米油中可导致肝重量增加、脂肪水平升高、血清尿素水平升高、肝酶活性升高以及肝损伤的明确组织病理学证据，并伴有单细胞坏死；而长期口服CCl4可引起明显的肝毒性，并导致肝纤维化、胆管增生，肝硬化甚至肝细胞癌。

四氯化碳的毒性有三、四种不同阶段，前2、3周主要表现为肝坏死，表现为肝特异酶活性升高，伪胆碱酯酶活性降低。在接下来的两到三周内，肝脏脂肪大量堆积，血清甘油三酯和天冬氨酸转氨酶（AST）水平显著升高，而肝功能降低。在第三阶段，AST继续升高，羟脯氨酸和甘油三酯水平升高，总体肝功能进一步下降。在最后阶段，伪胆碱酯酶进一步降低，可以观察到肝脏萎缩。

小鼠品系对四氯化碳的敏感性

小鼠对CCl4的易感性具有品系依赖性，尤其是BALB/c近交系小鼠对纤维化诱导最为敏感，而FVB/N小鼠对CCl4反应较差。尽管C57BL/6近交系小鼠仅发生中度肝纤维化，但由于基因修饰小鼠的现成性，该品系经常用于CCl4模型的纤维化研究。

品系

造模途径

敏感性

BALB/c

IP, SC, PO

Susceptible

C57BL/6

IP

Intermediate

DBA/2

IP

Intermediate

FVB/N

IP

Resistant

A

IP

Resistant

C3H/He

IP

Resistant, high mortality (>60%)

AKR

IP

Resistant, high mortality (>60%)

IP: intraperitoneal;

SC: subcutaneous;

PO: per os (via gavage).

四氯化碳造模时间和间隔

由于遗传原因和纤维发生的严重性（强度）有关，对CCl4的应用间隔和时间有不同的要求。每周两次在C57BL / 6自交小鼠中腹膜内（IP）施用CCl4，持续6周，或者每周3次，持续4周，导致肝内胶原基质的大量沉积和类似于人类3期的纤维化。在高敏感品系中，四周的CCl4应用通常足以诱导纤维化，而在抗纤维化品系中，低易感性品系小鼠可以通过长达12周的长时间诱导来弥补。

四氯化碳造模具体方法

一、腹腔注射造模

• 应称重小鼠（六至八周雄性C57BL / 6小鼠，体重约18–20 g）并检查是否有不适感（例如呼吸变化，毛发粗糙，异常行为，驼背姿势）。表现出这些异常的动物应排除在研究范围之外。

• 在玉米油中稀释的CCl4浓度通常为0.5至0.7 µL / g体重。使用CCl4诱导急性中毒模型通常使用更高剂量（0.8–2 µL / g体重），但应在1至3天后处死小鼠。请注意，注射溶液（CCl4或CCl4 /玉米油）应在室温下或接近体温。

• 应计算所需的CCl4体积。出于实际原因，建议始终注入恒定体积的50 µL，其中含有CCl4在玉米油中的溶液。因此，用玉米油补足所需的CCl4体积（0.5-0.7 µL / g小鼠体重）可达到50 µL的总体积。例如，将溶于40 µL玉米油中的10 µL CCl4注入到玉米油中。体重为20 g的小鼠，最终剂量为0.5 µL CCl4 / g体重。

• 注射后一小时应检查动物是否异常，此后每24小时检查一次。实验的终止以及后续CCl4的处理取决于每个研究的特定目标。如果需要立即进行促炎性改变，建议在24和48小时后收集组织。确立的纤维化最好在CCl4诱导2–4周后进行调查，而在诱导6–8周后可以观察到严重的纤维化（肝硬化）。实验结束时，应通过颈椎脱臼法处死动物。

二、吸入法造模

• 首先，在开始吸入四氯化碳之前，小鼠应接受苯巴比妥（饮用水中0.3克/升）一周。吸入四氯化碳的动物每笼最多只能饲养6只。

• 每次开始治疗前，应检查笼子和气体导管。四氯化碳应装入特定的蒸发瓶中。导管应置于烧瓶中CCl4流体表面下方至少2–3cm处。流速为2L/min的压缩空气泵入其表面下含有四氯化碳的烧瓶中，并从液体四氯化碳中鼓出。输送四氯化碳富集空气的管子应插入笼中。

• 每周三次（例如，星期一，星期三和星期五）短时间的CCl4暴露周期。条件应设置为：第一周起泡1分钟，在气体氛围中1分钟； 第二周鼓泡1.5分钟，在气体氛围中1.5分钟， 在整个实验的其余部分中，鼓泡2分钟，在气体氛围中2分钟。然后应在开始的三周内对小鼠进行一个周期的诱导（即每次诱导执行一次），在第四周内可进行两个周期，此后可对其进行三个周期诱导。先前的治疗包括两个或更多个周期，这些周期在不含CCl4的环境空气中呼吸2分钟即可。

• 处理后，应将笼子放在抽油烟机中再放置10分钟，然后再将其取下。

• 当小鼠出现腹水时，应停止吸入，因为腹水是门静脉高压的明确标志。动物应已达到门静脉高压症肝硬化的阶段，此时应进行实验（例如，对降压药的功效分析），或将动物处死以进行进一步分析（例如，在肝硬化肝脏中的基因和蛋白质表达）。

三、灌胃造模

不建议使用灌胃诱导，原因是灌胃诱导容易引起高死亡率。

腹腔注射造模

吸入法造模

灌胃造模

优点

具有良好的重复性、良好的存活率、实验易操作性并且实验操作安全性高

对于特定目的（如诱导门静脉高压症）或当四氯化碳吸入设备在实验室内建立时，吸入法造模可能更合适

缺点

腹腔注射CCl4的小鼠不会出现严重的长期并发症，且容易出现腹腔粘连。

需要建立吸入设备，小鼠会出现体重减轻，食物摄入减少，并且出现疲劳。

易引起高死亡率

结语

CCl4的应用对实验肝脏疾病研究十分重要，该模型具有成模率高，结果可高度重复的特点。经过总结，建议使用腹腔注射的方法进行诱导，更加方便快捷。

参考文献：Scholten D, Trebicka J, Liedtke C, Weiskirchen R. The carbon tetrachloride model in mice. Lab Anim. 2015 Apr;49(1 Suppl):4-11.

doi: 10.1177/0023677215571192. PMID: 25835733.