真菌诊断领域分子生物学的新进展

翻译整理 | 李姝

单位 | 河南沁阳市人民医院

原文 | White L P, Price J S. Recent Advances and Novel Approaches in Laboratory-Based Diagnostic Mycology[J]. J Fungi (Basel). 2021,7(1):41. doi: 10.3390/jof7010041.

COVID-19席卷全球，随之而来的是分子生物学快速走近了普通大众，从不知所云到人人皆知，大量的基层医院快速建设分子生物学实验室，迅速提高检测能力和检测水平。未来可期，分子生物学在基层医院会拥有无可替代的地位，比如传统病原学的检测，会越来越依赖分子生物学的诊断。

关注当下，展望未来，时刻关注分子生物学领域的最新进展，对于分子生物学从业人员相当重要。今天跟大家一起通过MDPI的一篇Review：《Recent Advances and Novel Approaches in Laboratory-Based Diagnostic Mycology》学习下在真菌诊断领域分子生物学的新的进展。

近年来真菌性疾病在很大程度上被忽视了，但随着免疫抑制或免疫调节(单克隆抗体疗法)的风险人群不断增加，再加上不可避免的真菌暴露和更灵敏的诊断方法面世，真菌性疾病将不可避免地增加。

当全世界都在努力应对COVID-19大流行时，真菌利用了这一形势，在重症COVID-19患者中导致严重的继发性侵袭性真菌病(IFD）。

近年来真菌学领域有了许多发展，真菌PCR检测已被标准化，并发布了商业检测方法，允许在非专业检测中心进行检测。

常见真菌(如念珠菌属和曲霉属)的耐药性是临床关注的问题，已经开发了快速识别这种耐药性的方法，同时克服了传统的局限性。

方法的标准化、商业PCR检测的可用性和外部质量保证计划〔分子诊断质量控制(QCMD)〕，显著提高了分子方法学在帮助诊断曲霉菌病、念珠菌病、毛霉菌病和肺孢子菌肺炎方面的接受度和使用范围。

完全自动化的商业分子平台的开发，能够直接处理采血管中真菌的存在，进一步增强了真菌诊断的能力，尽管平台的高测试成本，如T2Candida，可能限制其广泛的应用，但是不能否认T2Candida阴性对侵袭性念珠菌病(IC)的排除具有足够的灵敏度(NPV:≥98)，同时研究表明，T2Candida可以通过源头控制、降低治疗阶梯和确定治疗时间来预测患者预后。

主要临床应用如下：

1. 真菌耐药性的分子检测

由于抗真菌药物种类有限，IFD对抗真菌治疗耐药的出现在临床上非常值得关注。分子技术仍然是唯一能够通过筛选遗传标记〔单核苷酸多态性(SNPs)或串联重复序列〕或与固有耐药相关的真菌物种来识别潜在耐药性的非培养方法。

尽管不提供MIC数据，但是这些分子方法可能会提高灵敏度和缩短检测时间。已经开发出用于检测C.auris的PCR检测方法，Aspergenius（商品化试剂盒）实时PCR检测被用于区分烟土曲霉分型检测以及烟曲霉的唑类药物耐药性。

最初，鉴定与抗真菌耐药性相关的突变是通过多种内部分子方法和/或对靶基因(如烟曲霉的cyp51A)测序。最近也采用了实时荧光定量PCR方法，但通常只用于检测单个物种内的主要耐药性基因。

如今，商业分析方法可以检测常见的真菌病原体中的耐药基因。AsperGennius（商品化试剂盒）曲霉菌属的检测方法旨在检测烟曲霉中最常见的导致唑类耐药的突变(TR34/L98H,TR46/Y121F和TR46/T289A)，并已被用于直接标本检测。

同样，通过PneumoGenius（商品化试剂盒）检测肺孢子菌的耐药性是可行的，该方法鉴定了导致磺胺类药物(磺胺甲恶唑和氨苯砜)耐药性的二氢蝶酸合酶(DHPS)突变。MucorGenius（商品化试剂盒）毛霉菌病毒辅助诊断唯一商品化的PCR检测试剂。

使用环介导等温扩增(LAMP)更适合于在资源有限的环境下进行抗真菌耐药性的分子检测，并有可能转化为POCT设备。

同时建立了一种用于检测烟曲霉唑类耐药的TR34LAMP检测方法，检测结果快速，其比色变化可由肉眼或智能手机通过图像分析软件进行解释，在检测临床分离菌时具有良好的鉴别能力。

焦磷酸测序是一种替代方法，具有筛选特定靶基因内所有已知突变的潜力，并已成功应用于慢性肺曲霉病患者呼吸样本的检测。

2. 数字PCR

微滴式数字PCR(DD-PCR)是一种新技术，分离聚合酶链反应混合千倍，允许PCR扩增和荧光端点定量在每个单独的液滴。

DD-PCR的原理是在PCR扩增前对样品进行滴液化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。

经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判段读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳新微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

DD-PCR的主要缺点是检测高拷贝数(>105)的样本时性能较差，可能会影响拷贝数计算的准确性，并可能需要稀释样本。

DD-PCR已被用于检测呼吸道标本中的烟曲霉和土曲霉。与实时荧光定量PCR相比，针对烟曲霉28SrRNA的DD-PCR在检测分离株DNA时产生了更高的拷贝数，但在检测血液病病例的血清样本时并没有提高敏感性。

DD-PCR的概念代表了分子诊断领域一个令人兴奋的发展，因为它检测低拷贝数的潜力可能特别有利于血液样本的真菌PCR检测。

总结

基于方法标准化、真菌PCR检测的可用性和外部质量控制计划，第二次修订EORTC/ MSGGERC定义分类IFD允许包含分子测试,可能会增加真菌诊断领域的PCR测试，使和抗原检测相媲美。

PCR的广泛应用将进一步提高它们的吸引力和商业分子的可用性，PCR测试能够检测耐药种类(如念珠菌耳)或与耐药相关基因标记(例如,TR34/ L98H来自烟曲霉)，,通过克服传统真菌学和抗原检测的局限性，可能在处理后续病例是是有用的。

新的检测方式和手段还在不断的推陈出新中，放眼当下，展望未来，如何更好的利用好手中的武器去应对不断发生和发展中的疾病，这才是我们检验人应该不断思考的问题。

谨以此文，献给不畏艰辛，砥砺前行的分子生物学检验人。

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