唐本忠院士发表JACS:胞内温度探测器！AIE多色调谐纳米颗粒

温度可调节每个细胞内的生化反应，是细胞的关键物理参数。测试活细胞的温度，特别是病变细胞非常重要，例如炎症细胞和肿瘤细胞，它可以提供关于病理学和生理学的意见，有助于精确诊断和治疗。目前，许多方法可以检测细胞内温度，包括扫描探针显微镜，纳米级测温法，罗马光谱法。但是，这些现有方法都有许多缺点，如灵敏度低、受化学环境和周围介质的光学特性影响等。近期，唐本忠团队在《JACS》上发表“Multicolor Tunable Polymeric Nanoparticle from Tetraphenylethylene-Cage for Temperature Sensing in Living Cells”.作者以聚集诱导发光分子四苯基乙烯（TPE）为引发剂，通过原子转移自由基聚合（ATRP）合成两亲（N异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）聚合物（CNP）（流程1）。在水性介质中，两亲CNP自组装成纳米颗粒，并可以通过添加染色剂4-Dimethylamino 2'-butoxychalcone（DMBC，黄色发光）和尼罗河红（NR，红色发光）来调整其发射。基于荧光团之间的能量转移（FRET），通过协调这些荧光团的质量比，系统发光颜色改变。由于PNIPAM中异丙基之间的疏水相互作用与酰胺和水的氢键作用，CNP上的PNIAM会根据温度而收缩或延伸。因此，可逆的空间变化可调节荧光团的距离或苯环的分子内运动，FRET强度改变，最终实现热致变色。这种生物兼容的热响应材料可灵敏的探测细胞内温度。

流程1.PNIPAM聚合物（CNP）合成示意图。

1、TC1的结构

如图1 所示，TC1是两个螺旋桨状TPE，由四个三嗪单元固定，形成一个四方棱柱结构，体积约为9.4×7.0×5.6Å3。由于TPE单元由三嗪单元固定，TPE单元上苯环的旋转和振动受空间效应的限制，这使辐射衰减过程变得更为重要，因此，溶液中TC1具有荧光性质。

图1.TC1的X射线晶体结构的化学结构（a），俯视图（b）和侧视图（c）。

2、PNIPAM聚合物组装成温敏纳米颗粒

PNIPAM是典型的温敏聚合物（较低临界溶液温度（LCST）为32℃），用N-（2-氨基乙基）-2-溴-2-甲基丙酰胺修饰TC1来合成引发剂TC2。当TC2与800当量NIPAM在DMSO / i-PrOH中在室温下合成两亲CNP，CNP可以在水中组装成纳米颗粒，其中疏水TPE聚集，而亲水PNIPAM在室温下延伸到水中。浓度为0.5mg / ml时，CNP纳米颗粒在水中的流体动力学直径（Dh）为153 nm（图2a），TEM图像中的尺寸为50-100 nm（图2b）。CNP的临界凝胶化浓度（CGC）为1.5 wt％（图3c）。通过使用DLS和UV / vis光谱仪检测，溶液浊点为33°C，这通常与其他PNIPAM衍生物的LCST相同（〜32°C；图2d）。

图 2.CNP DLS分布图(a)和TEM图像(b),(c)TPE-PNIPAM溶液在20°C及50°C的照片,(d)CNP透射率和粒径与温度的关系

3、通过福斯特共振能量转移（FRET）调整多色发光

与一步能量转移相比，由三个或更多的荧光团组成的供体和受体发色团之间的级联FRET具有更强的Stokes 位移和颜色发光。根据受体的激发波长与供体的发射波长重叠原理，作者选择黄色发色团4-Dimethylamino-2'-butoxychalcone（DMBC）和红色发色团尼罗红（NR）作为供体或受体。添加DMBC的变化后，CNP的荧光强度逐渐降低，添加NR的变化时，DMBC的强度也逐渐降低，这证实了从CNP到DMBA再到NR的有效两步FERT。通过向CNP水溶液中加入不同剂量的DMBC和NR（0.5 mg / mL），可以将杂合纳米颗粒的荧光色调整为全色（图3）。当mCNP∶mDMBC∶mNR的质量比为1：6.40×10-3：2.24×10-3时，杂化纳米粒子的荧光可调成白光。

图3.添加DMBC和NR后，CNP的荧光谱图（a），荧光颜色变化（b）和紫外灯下的照片（c）。

由于CNP的可逆温度敏感性，杂化纳米粒子的荧光色具有可逆温敏。加热至45°C后，白色发光转换为橙色发光，冷却至室温后发光可恢复至白色（图4b和4c），37°C左右的温度分辨率至少为0.5°C。作者以两个过程来描述荧光颜色变化现象：1）在LCST以下，杂化纳米颗粒的荧光颜色略有变化。升温加速苯环的旋转和振动，荧光衰减，级联FRET效应会间接降低DMBC（530 nm）和NR（620 nm）的荧光强度。2）当温度达到LCST时，杂化纳米粒子的荧光进一步明显变为橙色。随着PNIPAM收缩，荧光团TC1，DMBC和NR将距离变近，三种荧光团之间的级联FRET效率提高。图4a中，在490 nm处的峰是TC1（450 nm）和DMBC（530 nm）的叠加，红色移至520 nm，这是因为更多的能量从荧光团TC1转移到DMBC。在25和45°C下，TC1对DMBC的FRET效率分别为63％和79％；TC1和DMBC组合对NR的FRET效率分别为57％和85％。因此，在25°C和45°C下，该系统的整体FRET效率分别为36％和70％。

图4.(a)纳米粒子在不同温度下发射白光的荧光光谱，以及纳米粒子可逆热致变色的荧光光谱(b)和相关CIE图(c)。

4、通过颜色变化检测细胞温度

作者将白光发射杂化纳米颗粒（WCNP）作为细胞内温度探针引入细胞中。WCNPs具有良好的生物相容性，在HeLa细胞中未检测到细胞毒性（图5a），且WCNP在整个细胞质中分布（图5b）。25°C时重叠的图像显示出白光发射，与溶液中的WCNP相似，表明它们在细胞质中稳定组装。随着将温度从25°C升高到45°C，450-530 nm之间的荧光强度降低，而620 nm处的荧光强度增加，荧光颜色从白色变为红色。作者还用流式细胞仪定量分析细胞内荧光强度的变化。如图5c所示，随着温度的升高，NR与CNP的荧光强度之比（ICNP / INR）及NR与DMBC的荧光强度之比（IDMBC / INR）均随温度的升高而增加。这些结果都表明WCNPs是理想的细胞内温度探针。

图5.(a)杂合纳米颗粒在HeLa细胞中的MTT分析,(b)以及在不同温度下的共聚焦显微镜图像,(c)不同温度下荧光变化

结论

作者提出了一种通过ATRP合成基于TPE的聚合物CNP的方法。通过级联FRET将客体染料封装到疏水域中，可调整CNP的荧光色，这为在水性溶液中构建全光谱发光杂化纳米粒子提供了一种简单的方法。此外，通过利用CNP的温度敏感性，该杂化纳米颗粒可以用作细胞温度探针。该荧光探针不仅具有易读取和高分辨率的特点，还可避免繁琐的合成，具有成本效益。

参考文献：doi.org/10.1021/jacs.9b11544

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