植物乳杆菌还原形成不同粒径纳米硒的培养条件及其生物活性分析

硒主要以无机化合态硒、有机硒及无机单质硒形式存在，能以一种或者多种形态进入生物体。不同形态的硒，其毒性存在差异，其中无机化合态硒毒性最高，其次为有机态硒，单质硒毒性最弱。单质纳米硒因其低细胞毒性和高生物学活性受到了人们的广泛关注。生物法合成的纳米硒，由于经过生物体的转化，不仅大大减少了其对机体的毒性，而且能更方便被机体吸收和利用，更好地发挥硒的生物学功能。研究发现，许多微生物具有还原亚硒酸钠合成纳米硒的功能。

由于其益生性，乳酸菌可作为合成生物源纳米硒的良好载体和转化体，作为食品添加剂进行补硒。纳米颗粒的粒径与其生物学活性具有相关性。研究发现，当大多数纳米化学物质的粒径减小时，其化学、物理和生物学性质会发生改变。

为探究基本培养条件对乳酸菌纳米硒粒径形成的影响，并分析不同粒径纳米硒颗粒的生物学活性差异，西北农林科技大学食品科学与工程学院的张羽竹、王冰宜、樊明涛*和魏新元*等人选用常见的益生乳酸菌——植物乳杆菌作为实验菌株，分析培养条件对纳米硒粒径的影响，并在此基础上探究其粒径与体外抑菌活性和抗氧化活性的相关性。

1 富硒植物乳杆菌的筛选结果

结果显示，菌株WZ1、WZ2、WZ3、WZ7、WZ8、WZ9、WZ10和WZ11均能在含硒培养液中生长，其中WZ1、WZ2、WZ8生长旺盛，因此选取该3 株菌进行进一步研究。

2 亚硒酸钠质量浓度对植物乳杆菌生长的影响

结果显示，当亚硒酸钠质量浓度不高于80 μg/mL时，3 株植物乳杆菌生长状况受硒的影响较少，其中WZ8生长状况最好；在亚硒酸钠质量浓度为80 μg/mL时，菌落数均达到了峰值，WZ1为（1.53±0.12）×108 CFU/mL，WZ2为（1.39±0.13）×108 CFU/mL，WZ8为（1.98±0.15）×108 CFU/mL。

3 适宜亚硒酸钠质量浓度的确定

结果显示，菌体沉淀颜色与亚硒酸钠质量浓度呈正相关：随着亚硒酸钠质量浓度增加，菌体沉淀颜色逐渐变浓。随着亚硒酸钠质量浓度的增加，菌株的富硒量会随之增加，菌株的生物量则会减少。但从益生效果以及机体吸收利用的角度考虑，应在保证菌株生物量的前提下获得较多的单质硒，故选择菌体沉淀为粉色时的浓度较为适宜。从菌体沉淀的颜色变化中选择使其呈现粉色对应的为亚硒酸钠适宜质量浓度，即WZ1、WZ2、WZ8适宜的亚硒酸钠质量浓度均为80 μg/mL。因此，选择WZ8为实验菌株，亚硒酸钠质量浓度为80 μg/mL进行下一步研究。

4 培养条件对纳米硒粒径及其硒含量的影响

结果显示，pH 4.0和pH 6.8条件下产生的纳米硒粒径之间不存在显著性差异，但它们均与pH 8.0条件下的纳米硒粒径之间存在显著性差异。当起始pH值为8.0时，纳米硒粒径最大；起始pH值为6.8时，粒径最小。纳米硒颗粒的硒含量随着培养液起始pH值变化而改变，两两之间存在显著差异。

植物乳杆菌WZ8在25 ℃和35 ℃条件下还原亚硒酸钠形成硒颗粒，粒径无显著差异，二者与45 ℃条件下形成的粒径之间存在显著差异。45 ℃形成的纳米硒粒径几乎是另外两种温度条件下的2 倍。不同培养温度下，纳米硒颗粒的硒含量之间存在显著差异，其中35 ℃条件下的纳米颗粒中硒含量最高。

3 种接种量形成的纳米硒，其粒径以及硒含量两两之间均具有显著差异；当接种量为2%时得到纳米硒粒径最大，接种量为4%时则最小；当接种量为2%时，纳米颗粒硒含量最高，接种量为1%时最低。

只有60 μg/mL和100 μg/mL亚硒酸钠质量浓度下形成的纳米硒粒径之间存在显著性差异；而不同亚硒酸钠质量浓度下形成的纳米颗粒硒含量之间均具有显著差异，随着培养体系中的亚硒酸钠质量浓度增加，纳米硒粒径增大，其颗粒中的硒含量也随之增加。

胁迫12 h和19 h形成的纳米硒粒径之间无显著差异，但均与胁迫5 h之间存在显著性差异，其中胁迫19 h的粒径最大，胁迫5 h的粒径最小。不同胁迫时间下，WZ8还原形成纳米颗粒的硒含量间均具有显著差异，胁迫12 h的硒含量最高。

综上，植物乳杆菌WZ8在还原形成纳米硒颗粒时，颗粒的粒径及其硒含量均受到培养条件的影响。其中菌株的接种量对纳米硒粒径影响最大；而当培养温度、亚硒酸钠质量浓度以及胁迫时间改变时，纳米硒粒径的变化呈现出一定的规律性：随着培养温度的升高、亚硒酸钠质量浓度增加以及胁迫时间的延长，纳米硒粒径增大。而不同培养条件下形成的纳米颗粒的硒含量各不相同，各因素不同水平之间，颗粒中的硒含量两两间均存在显著差异。

5 纳米硒颗粒的选择

参考连续性变数资料整理方法，根据制得纳米硒粒径，将其分为5 组。结合纳米硒粒径分布及其差异显著性，分别从各组中选择一份样品，编号为（按粒径从小到大排列）E1、D3、E2、C2（粒径分布如图1所示）。在控制培养体系最终硒含量一致的条件下，对它们的体外抑菌性以及抗氧化性进行了测定。

图1 为所选择的几种代表性纳米硒的粒径分布。样品E1粒径分布约为74～238 nm，平均粒径为（1 8 0.1 8±5 2.5 0）n m；样品D 3 粒径分布约为43～295 nm，平均粒径为（270.27±35.14）nm，样品E 2 粒径分布约为1 6 4 ～4 3 9 n m，平均粒径为（4 2 3.0 7±4.5 5）n m；样品C 2 粒径分布约为288～778 nm，平均粒径为（743.33±50.50）nm。

6 不同粒径纳米硒颗粒生物学活性分析

6.1 抑菌活性

如图2所示，不同粒径纳米硒颗粒对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及单核细胞性李斯特菌的抑制作用相似，均为E1＞D3＞E2＞C2。结合纳米硒粒径可知，纳米硒粒径越小，其对4 种指示菌的抑制作用越明显。

6.2 抗氧化活性

不同粒径的纳米硒颗粒，其清除自由基的能力以及总还原力不同（图3）。4 种纳米硒颗粒清除ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力，两两之间存在显著差异，其中E1对ABTS阳离子自由基清除能力最强，E2则对羟自由基清除能力最强。由纳米硒的DPPH自由基清除率可知，除E2、C2外，其余两两间存在显著差异，其中E1的DPPH自由基清除率约为E2或C2的3 倍；另外，除D3与C2、E2与C2外，其余两两间的总还原力存在显著差异。综上，纳米硒的抗氧化活性与其粒径存在一定的相关性。

讨论与结论

研究结果表明，培养液起始pH值、培养温度、接种量、亚硒酸钠质量浓度以及胁迫时间等均会影响植物乳杆菌WZ8还原形成的纳米硒粒径。体外抑菌实验的结果表明，不同粒径纳米硒颗粒对4 种食源性致病菌的抑制作用不同，粒径较小的纳米硒颗粒对同一致病菌的抑制作用较强。

本实验研究了培养条件对纳米硒粒径的影响，以及不同粒径纳米硒的体外抑菌活性、抗氧化活性与粒径之间的相关性，并结合不同培养条件下粒径的差异显著性和菌株生长条件，得到最佳获得高生物学活性纳米硒颗粒的培养条件为：起始pH 6.8、培养温度35 ℃、接种量4%、亚硒酸钠质量浓度80 μg/mL、胁迫时间5 h。但培养条件对纳米硒粒径影响的作用机理尚不明确，仍需进一步的研究和探索。

本文《植物乳杆菌还原形成不同粒径纳米硒的培养条件及其生物活性分析》来源于《食品科学》2020年41卷22期119-126页，作者：张羽竹，王冰宜，曾梓敖，徐若芸，李军，樊明涛，魏新元。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191013-098。

近期研究热点

修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

图片来源于摄图网和文章原文