撰文 | Qi
责编 | 兮
微小染色体维持蛋白（Minichromosome maintenance proteins,MCM）是DNA依赖性ATPase，可与复制起点结合并支持DNA复制。大量MCM2-7在G1期的染色质上组装为被称为“复制许可证”的复制前复合物（pre-replication complexes, pre-RCs），然而，其中只有一小部分成为基因组复制所需的CDC45-MCM-GINS（CMG）解旋酶复合物，而其余“休眠”的pre-RCs功能仍然未知【1-4】。截至目前，人们尚不清楚细胞为什么会产生大量多余的MCMs，它们如何设法在“多代”中维持数量，以及为什么MCM库即使轻度降低也会损害复制基因组的完整性【5,6】。
近日，来自丹麦哥本哈根大学的Kumar Somyajit团队和Jiri Lukas团队在Nature杂志上合作发表了一篇题为“Equilibrium between nascent and parental MCM proteins protects replicating genomes”的文章，在这项研究中，作者提出母代细胞通过回收染色质结合的亲代MCM并同时合成新生MCM以维持MCM库的稳定，从而确保子代细胞一旦进入细胞周期即可获得足够数量的具备“许可”资质的MCM库，而MCMBP（微小染色体维持复合物结合蛋白）的缺陷会引起新生MCM库的不稳定及并阻止其核易位，从而导致复制叉移速和对称性异常，诱发内源性复制应激和DNA损伤，由此强调亲本和新生MCM库的平衡对于维护基因组复制稳定性的重要意义。
首先，作者在人U2OS细胞系中融合了内源性MCM4和HaloTag，基于定量图像的细胞计数法（Quantitative image-based cytometry, QIBC）证实HaloTag荧光配体已标记所有核MCM4。当脉冲标记的荧光HaloTag（Janelia Fluor, JF549）被非荧光阻滞剂追踪时，核MCM4-Halo的水平逐渐下降，而在连续标记的过程中则保持稳定，提示存在新合成的蛋白不断补充MCM库。作者随即使用双重标记的方法来监控内源性MCM4蛋白的动态变化。通过添加阻滞剂暂时分离具有两个不同荧光标记的HaloTag配体（JF549和JF646），在整个细胞周期中，用JF549配体脉冲标记的MCM4的水平逐渐下降，而对JF646配体的追踪显示了新MCM4的产生。在有丝分裂前不久，既有蛋白和新合成蛋白的组合使MCM的总库增加了一倍，从而确保子代细胞获取的总MCMs数量与其母代细胞的细胞周期开始时相同（见下图1）。作者将标记JF549的MCM称为“亲本”，因为在母代细胞染色质上作用过才传递至子代，相反，将标有JF646的MCM称为“新生”，其在S阶段产生且无需事先参与pre-RCs就传递给子代细胞。
图1，新生MCM不断补充母细胞中的亲代MCM
为了评估子代细胞所继承的“亲本”和“新生”MCMs的功能，作者随即研究了它们各自对pre-RCs的贡献。QIBC结果显示，在子代细胞中新生MCD4和亲本MCM4成为pre-RCs比例约为2：1，尽管两个组分在G1期均显示出类似的pre-RCs形成动力学，但亲本MCMs在S期从染色质上解离的动力学更慢。为了直接将MCMs库的独特动力学与复制功能联系起来，作者分析了它们与CDC45的相互作用。值得注意的是，尽管子代细胞的新生MCM约为亲本MCM的两倍，但它们形成的CMG比例仅为1：1，这表明亲本MCM转换为活性复制体的效率是新生MCM的两倍。
那么，MCM蛋白是如何维持其稳态水平以及子代细胞所继承的亲本和新生库之间的比率呢？为此，作者分析了微染色体维持复合物结合蛋白（MCM-binding protein, MCMBP）的交互基因组。MCMBP与除MCM2或CMG成分以外的所有MCM亚基均存在相互作用。作者在含有内源性标记MCMBP–AID–GFP且包含MCM4–Halo的U2OS细胞系中分析了新生和亲本MCM4。其中，MCMBP–AID–GFP由于框内插入生长素诱导降解因子（auxin-inducible degron, AID），易于通过生长素IAA的处理而发生降解。结果显示，尽管亲本MCM4-Halo的动力学保持不变，但MCMBP降解后新生MCM4-Halo的核积累明显延迟，且新生MCMs的水平降低减弱了子代细胞中pre-RCs的形成。
值得注意的是，在实时追踪MCMBP-degron细胞的过程中，作者发现MCM4-Halo的核蓄积受损并伴有其在细胞质中的保留，这一现象提示MCMBP可能具备促进MCM亚基入核的作用。的确，MCMBP的N端包含核定位信号（nuclear localization signal, NLS），删除它既消除了MCMBP的核输入，也消除了MCM3-7的核输入。如果破坏MCMBP–MCM结合所需的Walker B样基序，也同样会将MCM3–7错误定位到细胞质中。此外，作者还发现MCMBP敲除细胞中新生MCM3-7在胞质中蛋白水平降低，而MG132的处理可以稳定其蛋白水平（见下图2）。因此，这些结果表明MCMBP是一种多功能的分子伴侣，可以通过与MCM亚基的直接物理相互作用来促进其核易位并维持蛋白稳定性。
图2，MCMBP能够稳定新生MCM3-7并促进其核易位
接下来，作者想知道MCM库的不稳定对细胞复制会存在哪些影响？作者使用DNA纤维技术测量相邻活跃的复制叉之间的距离，以评估局部叉密度（local fork density,LFD），与pre-RCs减少一致，MCMBP敲除细胞的LFD轻度降低。此外，在MCMBP-degron细胞中，MCMBP的强制降解会损害MCM继承，pre-RCs形成，S期特异性DNA损伤反应增加以及子代细胞中产生微核（micronuclei）。值得注意的是，将受调节的MCMBP降解与DNA纤维技术结合使用表明，pre-RCs减少会提高复制叉的整体速度，而不会影响染色质结合的复制体组件PCNA。因此，这些结果说明MCMBP缺乏时观察到的异常快速的复制叉是由于染色质结合的MCM减少，而与活性复制体无关。
最后，作者试图了解为什么pre-RCs形成减少会引起复制体加速从而导致DNA损伤。首先考虑到装载于染色质的MCM2-7复合物可能对渐进的复制叉产生抗性的可能性，并且缺乏这种物理或拓扑约束可能会释放不受控制的复制叉前进，并可能伴随频率更高的暂停或停止事件。确实，作者在MCMBP或CDC6缺失的细胞中发现复制叉不对称的发生率增加了。因此，这些观察结果提示结合于染色质的MCMs的缺乏通过将复制叉的速度提高到生理极限以上而引起DNA损伤。同时，支持该结论的是通过使用低剂量的DNA聚合酶抑制剂Aphidicolin降低复制叉移动速度，可以防止复制叉叉不对称并抑制MCMBP-degron，MCMBP敲除和MCMBP-NLS缺陷细胞中的DNA损伤。
总的来说，这项研究揭示了细胞如何在多代中维持充裕的MCM亚基，以减轻内源性DNA复制压力。新生MCM以独立于CMG的方式集成到复制程序中，以确保双向复制叉的速度和对称性，因此，MCM的大量剩余对于维持复制叉的生理步调而言至关重要，作者将这种过量MCM的功能命名为“叉速管理（fork-speed management）”。这一概念也可以解释为什么MCM水平即使是微小的变化都与不稳定的Mcm4Chaos3等位基因纯合小鼠胚胎的自发肿瘤形成和基因组不稳定的发生率增加相关【7】。此外，基于MCMBP在新生MCM维持中的关键作用，作者认为MCMBP的药理学抑制作用可能是通过增加病理性复制叉加速引起的内源性复制应激从而使导致癌细胞对目前可用的治疗方式敏感【8】。
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2842-3
1. Deegan, T. D. & Diffley, J. F. MCM: one ring to rule them all.Curr. Opin. Struct. Biol. 37, 145–151 (2016).
2. Burkhart, R. et al. Interactions of human nuclear proteins P1Mcm3 and P1Cdc46. Eur.J. Biochem. 228, 431–438 (1995).
3. Walter, J. & Newport, J. W. Regulation of replicon size in Xenopus egg extracts.Science275, 993–995 (1997).
4. Khler, C. et al. Cdc45 is limiting for replication initiation in humans.CellCycle 15, 974–985 (2016).
5. Liang, D. T., Hodson, J. A. & Forsburg, S. L. Reduced dosage of a single fission yeast MCM protein causes genetic instability and S phase delay. J.CellSci. 112, 559–567 (1999).
6. Orr, S. J. et al. Reducing MCM levels in human primary T cells during the G0→G1 transition causes genomic instability during the first cell cycle.Oncogene29, 3803–3814 (2010).
7. Shima, N. et al. A viable allele of Mcm4 causes chromosome instability and mammary adenocarcinomas in mice.Nat. Genet. 39, 93–98 (2007).
8. Somyajit, K. et al. Redox-sensitive alteration of replisome architecture safeguards genome integrity.Science358, 797–802 (2017).
制版人：嘉
特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。
Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.
