Cell Stem Cell丨肺部疾病研究新工具：iPSC诱导的气管基底干细胞

撰文 | 咸姐

人类肺部小气道在如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、闭塞性细支气管炎和囊性纤维化等多种肺部疾病中均会发生病变，称为病理性气道重塑，可影响上皮细胞、基间质以及这些组织之间的相互营养作用。正常人的气道大部分是由纤毛细胞、分泌细胞和6-30%的基底细胞组成的假复层上皮，这些细胞的比例沿近-远端轴变化。其中基底细胞（basal cell，BC），因其接近基底层而得名。BC丰富的细胞骨架蛋白、连接蛋白和粘附蛋白有助于将上皮细胞锚定在基质上，并将底层基质与外界隔绝。目前的实验已证实，气道BC是相对未分化的多能干细胞群，可以作为重要的特殊上皮细胞类型（如分泌细胞SC和多壁细胞MCC）的前体再生气道上皮细胞，从而促进正常上皮细胞的稳态和损伤后上皮细胞的有序再生，并且可能参与了一些呼吸系统疾病的易感性、启动和发展【1,2】。

BC表达多种标志物，包括肿瘤蛋白63（TP63）、细胞骨架蛋白角蛋白5（KRT5）和神经生长因子受体（NGFR）。尽管成人肺部的气道BC已被广泛研究，但对其发育起源的研究直到最近才兴起。小鼠的谱系追踪实验显示，在最初肺芽形成（胚胎期9.5 [E9.5]）的肺上皮祖细胞亚群中，Tp63程序已经存在于肺发育的早期阶段，表达标记所有发育中肺上皮细胞的转录调节因子——NK2同源框1（Nkx2-1）。由于缺乏BC形态和分子程序，早期的Nkx2-1+/Tp63+共表达细胞并不属于BC，相反，这些胚胎细胞可以作为随后肺泡和气道上皮的多潜能祖细胞发挥作用。最初，Tp63在未成熟的气道祖细胞中广泛表达，后来则逐渐局限于定位在基底膜且上调成人BC标记物（Krt5和Ngfr）的气管细胞亚群中【3】。

目前，控制肺内BC规范和成熟的信号通路尚不清楚，不过，根据气道BC的干细胞特性，包括其增殖潜能，研究人员已经开发出成熟的方案在体外扩大培养人原代BC。这些BC通常被称为人支气管上皮细胞（HBEC），可在气液界面（ALI）培养中分化为假复层气道上皮细胞，再现了体内气道生物学的各个方面。通过这一模型，对获得性和遗传性的人类气道疾病，包括哮喘的粘液化生、囊性纤维化（CF）的氯离子转运缺陷以及原发性纤毛运动障碍(PCD)的纤毛功能障碍等的认识有了新的进展【4,5】。而随着人类诱导多能干细胞（iPSC）的发展，人们意识到从iPSC中获得组织特异性干细胞将对再生医学具有广泛而深远的意义。近年来已有研究成功从iPSC定向分化为气道上皮细胞类型，包括表达经典BC标记的TP63的细胞，然而产生具有与成人BC相似的干细胞特性的详细特征的真正的BC尚未被报道。

2020年10月23日，来自美国波士顿大学和波士顿医学中心的Darrell N. Kotton团队在Cell Stem Cell在线发表题为“Derivation of Airway Basal Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells”的文章，首次报道了一种可以从人iPSC获取气道基底细胞（iBC）的定向分化方案，由此得到的iBC含有原代基底细胞的干细胞特性，包括自我更新和多系分化潜能，从而为体外气道疾病建模和体内气管异种移植物的再增殖提供了巨大的机会。

已知NKX2-1是所有发育中的肺上皮细胞内最早表达的转录调节因子，而TP63是BC程序表达所需的经典转录因子，因此本文的研究人员首先建立了一种工具，能够可视化并纯化来自体外iPSC的NKX2-1+/TP63+的肺基底细胞，同时排除任何非基底细胞（NKX2-1-/TP63+），即GFP和tdTomato双荧光报告iPCS细胞系BU3 NKX2-1GFP;P63tdTomato（BU3 NGPT）。利用该iPSC细胞系诱导肺祖细胞近端气道定向分化的过程中（图1），研究人员发现，TP63 tdTomato（简称TOM+）最早表达于分化第15天左右的NKX2-1GFP+（简称GFP+）细胞中，并且发现分离出来的NKX2-1GFP+/ TP63 TOM+单细胞可以在气道无血清培养基（FGF2+10+DCI+Y）的3D培养条件下增殖。

图1 气道定向分化示意图

随后，研究人员从自我更新能力、多系分化潜能和典型BC标记物NGFR的表达等方面对气道分化产生的NKX2-1GFP+/TP63 TOM+细胞进行表征，结果显示GFP+/TOM+细胞的NGFR低表达，且多系分化不一致，提示其尚不是成熟的BC。但是将分化第30-32天的GFP+/TOM+细胞分离出来，放入适合原代人类BC培养的BC培养基（含有SMAD和ROCK信号小分子抑制剂）继续3D培养后，GFP+/TOM+细胞球体表现出管腔不明显，且细胞内的NGFR可以被快速地诱导。随后，单细胞测序（scRNA-seq）结果显示， NGFR只在BC培养基培养的基底样细胞群中表达，并且此细胞群表现出最强的BC转录组特征，表达典型的BC标志物，由此表明BC培养基诱导的NGFR表达增加与成熟BC程序的增强一致。BC培养基培养下的GFP+/TOM+细胞与成人基底细胞有着最大的转录相似性，被称为iBC。

进一步的实验证实iBC具有与气道干细胞相同的关键特性——长期自我更新和多潜能分化。在BC培养基中，研究人员可以很容易地在iBC培养物的最外层细胞层中识别出NKX2-1GFP+/TP63TOM+细胞，而在ALI分化培养基中，BC、MCC和SC均可被鉴定出。为了更全面地评估iBC产生的分化细胞类型的分子表型，研究人员对2D ALI培养基培养的根据NGFR进行分选的细胞进行了scRNA-seq分析，鉴定出5类具有类似气道上皮细胞类型的基因表达谱的细胞群以及一类增殖细胞群，同时检测到与HBEC来源的BC、SC和MCC一致的基因表达模式的细胞。与体外分化培养一致的是，在小鼠体内气管移植模型中，iBC也可以形成与真实的体内气道相似的气道上皮细胞结构和组成。

至此，研究人员成功获得了iBC的定向分化方案，然而要扩大其应用价值，首先要实现的是在不需要向细胞中引入荧光报告基团的基础上将各种正常或患者特异性iPCS细胞系分化为iBC。通过实验，研究人员利用基于抗体的NGFR+细胞分选代替了GFP+/TOM+分选，从而成功从五类不同的iPSC/ESC细胞系分化出由BC、SC和MCC组成的假复层上皮细胞。与此同时，研究人员证实iPSC来源的气道上皮细胞与人类气道上皮细胞具有共同的关键生理和生物学特性，不使用荧光蛋白报告系统纯化的患者特异性iBC同样可以模拟三种具有不同上皮特征的气道疾病的特征，包括哮喘中的粘液细胞上皮化生、CF中的离子通量异常和PCD中的纤毛运动缺陷。

综上所述，本文报道了从iPSC定向分化为组织特异性干细胞——气道iBC的方法，这些分化的细胞在分子和功能上均与人类气道的重要干细胞——基底细胞非常相似，并且展现了这些iBC在模拟人类气道发育和疾病方面的潜力，在异种气管移植模型中证明了其体内再生气道上皮细胞的能力。本文呈现的对组织特异性干细胞气道BC的诱导分化、纯化、扩大和冷冻能力，克服了目前iPSC技术在呼吸道粘膜和肺上皮疾病研究中面临的许多关键障碍，必将大大加速对人类肺部疾病的研究。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.09.017

制版人：嘉

参考文献

1. Rock, J.R., Randell, S.H., and Hogan, B.L.M. (2010). Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling. Dis. Model. Mech. 3, 545–556.

2. Rock, J.R., Onaitis, M.W., Rawlins, E.L., Lu, Y., Clark, C.P., Xue, Y., Randell, S.H., and Hogan, B.L.M. (2009). Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 106, 12771–12775.

3. Yang, Y., Riccio, P., Schotsaert, M., Mori, M., L€u, J., Lee, D.-K., Garca-Sastre, A., Xu, J., and Cardoso, W.V. (2018). Spatial-temporal lineage restrictions of embryonic p63+ progenitors establish distinct stem cell pools in adult airways. Dev. Cell 44, 752–761.e4.

4. Clancy, J.P., Cotton, C.U., Donaldson, S.H., Solomon, G.M., VanDevanter, D.R., Boyle, M.P., Gentzsch, M., Nick, J.A., Illek, B., Wallenburg, J.C., et al. (2019). CFTR modulator theratyping: current status, gaps and future directions. J. Cyst. Fibros. 18, 22–34.

5. Horani, A., Ferkol, T.W., Dutcher, S.K., and Brody, S.L. (2016). Genetics and biology of prima