CHOM | 新冠病毒表面刺突蛋白的实时构象变化过程

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众多正在传播的人类致病性病毒表面具有脂质双层膜和镶嵌在膜上的包膜蛋白，或者叫融合蛋白、刺突蛋白、信封蛋白。因此这类病毒可以归类为包膜病毒，这其中包括艾滋病毒HIV, 新冠病毒SARS-CoV-2, 流感病毒Flu，埃博拉病毒Ebola，寨卡病毒Zika， 登革热病毒Dengue等等。该类病毒通过其最表面刺突蛋白来诱导病毒和靶细胞膜的融合，从而引发对靶细胞的感染。虽然针对一些包膜病毒，目前已有有效的疫苗来控制其在人类中的传播。但对于大多数病毒，目前尚无预防或有效治疗方法，例如艾滋病毒HIV和新型冠状病毒SARS-CoV-2。已经成功的疫苗一般是通过诱发人体免疫细胞产生抗体来结合病毒表面的刺突蛋白，从而达到阻断膜融合过程，最终阻止病毒进入靶细胞。病毒膜融合蛋白，即刺突蛋白，是诱导膜融合反应，允许病毒进入细胞的关键因素。作为包膜病毒的一种，新冠病毒表面具有刺突蛋白，该蛋白介导与细胞表面的附着以及诱导随后的膜融合反应，最终导致病毒进入细胞进行感染。

新冠病毒的刺突蛋白位于病毒表面，介导病毒与受体ACE2结合，诱导随后发生的病毒进入细胞，从而感染细胞并产生新的病毒颗粒。刺突蛋白像一把钥匙打开了受体细胞的大门。该蛋白也是免疫系统识别的主要目标，是抗体的主要识别对象，因此是目前新冠疫苗和抗体药物研发的关键靶点。但是，刺突蛋白在病毒表面上不停的切换构象 （形状或结构，shape-shifting）, 可以比喻成变形金刚。刺突蛋白在病毒表面的动态构象变化，一方面释放能量最终将病毒送入细胞，另一方面协助病毒逃脱免疫系统的检测 – 免疫逃逸。众多的结构研究表明，新冠病毒的刺突蛋白具有多种构象/结构，其受体结合域（RBD）具有：‘向下’的关闭状态；与受体结合后‘向上’的打开状态。但是，刺突蛋白如何从‘向下’转变到‘向上’，以及有无中间体状态的实时信息，即动态变化信息是缺失的。

2020年11月13日，来自耶鲁大学医学院Walther Mothes实验室的卢茂林博士在Cell Host & Microbe发表了题为：‘Real-time Conformational Dynamics of SARS-CoV-2 Spikes on Virus Particles’的研究，利用单分子荧光共振能量转移（smFRET）填补了关于在新冠刺突蛋白构象动力学研究方面的空白。

图一 单分子技术smFRET研究刺突蛋白在病毒表面的实时构象变化过程

在这项关于新冠的研究中，卢茂林博士等在不影响病毒活性的情况下，成功在刺突蛋白两个区域引入荧光标记位点，通过实时监测荧光分子之间的能量转移（smFRET）来反映标记位点之间的相对距离变化 （一般在3nm 到8 nm之间），从而实现对刺突蛋白的动态构象变化过程的实时观察。研究人员将刺突蛋白镶嵌在两种病毒颗粒上，通过smFRET观察刺突蛋白在病毒表面所呈现的状态，得出一致结论：在病毒表面，刺突蛋白至少呈现四种不同构象状态。研究人员进一步指出，刺突蛋白表现出确定的构象转变序列，人体受体ACE2 （hACE2）通过一种必要的中间体将其从‘基态’激活到‘激活态’。。研究人员通过一系列的实验进一步鉴定出，在这四种构象状态中：一种为‘基态’，对应结构的‘向下’状；一种为‘激活态’，即受体结合状态，对应‘向上’状态’；一种为中间‘不对称’状态；另一种需要进一步研究来确认。另外，研究人员进一步发现，Serine蛋白酶的蛋白水解加工可以促进刺突蛋白从基态到激活态的激活过程，但是这个过程依赖于受体hACE2。

图二 受体和抗体对刺突蛋白构象状态的调控

接下来，研究人员分析了刺突蛋白与抗体结合后会发生什么构象变化。通过研究一名新冠恢复期患者血浆中的抗体发现：该抗体可以稳定‘基态’构象，从而可以阻止刺突蛋白与受体hACE2结合。该抗体与受体的竞争并未影响其对刺突蛋白的识别，这表明其拮抗刺突蛋白，即中和病毒活性的机理，并不仅仅依赖于受体结合域。通过研究另一名新冠恢复期患者血浆中的抗体以及其他多种针对受体结合域的单克隆抗体，研究人员发现该类抗体针对刺突蛋白‘激活态’构象，类似于受体hACE2与刺突蛋白的结合倾向。以上结果表明：新冠病毒可能以不同的方式被抗体中和。一方面，抗体可以通过模仿受体并与之竞争与刺突蛋白结合。另一方面，抗体也可以通过稳定刺突蛋白的‘基态’构象，从而可以防止刺突蛋白与宿主细胞结合。

图三 刺突蛋白的构象状态分布，构象间动态转换，受体激活，以及抗体拮抗机制

总结来说，新冠病毒表面刺突蛋白具有多种构象形态，或结构状态。卢茂林博士等通过单分子技术smFRET实时观察到刺突蛋白的构象变过程，并描述了刺突蛋白在被受体激活或抗体拮抗后，其构象格局如何变化。研究人员主要有四点重要发现：1）刺突蛋白在至少4种不同的构象状态中不停切；2）受体hACE2通过中间体将刺突蛋白从基态激活到激活状态；3）刺突蛋白的蛋白水解过程可加速刺突蛋白被受体激活的过程；4）抗体可以通过两种不同的中和机制拮抗刺突蛋白，因此，设计有效疫苗或药物的策略可以使用不同的方法来调控刺突蛋白。

其中，卢茂林博士为第一作者，卢茂林博士和Walther Mothes博士为共同通许作者。该研究是与美国国立卫生院疫苗研究中心（NIH/VRC）的Peter Kwong和John R. Mascola，St. Jude Children's Research Hospital 的Scott C. Blanchard, 以及Columbia University 的David D. Ho(何大一)等研究团队合作完成。值得一提的是，2019年，卢茂林博士等利用相同的单分子技术发表了关于艾滋病毒表面刺突蛋白的研究工作（Maolin Lu et al. Associating HIV-1 envelope glycoprotein structures with states on the virus observed by smFRET. Nature , 2019, doi: 10.1038/s41586-019-1101-y）。新冠病毒与艾滋病毒的表面刺突蛋白，有很多共同点。

https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.11.001

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