浓香型白酒新、老窖池池壁泥与池底泥原核菌群结构分析

浓香型窖泥中富含大量厌氧菌群，对提高白酒发酵质量具有重要作用。现已知窖池越老窖泥菌群越丰富，酒质越好。窖泥菌群需要25 a达到老熟状态。在窖泥菌群老熟过程中，窖泥菌群与其所在的理化环境相互适应、相互影响。由于池底泥与池壁泥所处的理化环境截然不同，因此有必要将池壁泥和池底泥分开研究，对详细了解窖泥的老熟具有重要作用。在实际酿酒中，一般分层出醅分层蒸酒，靠近池底泥的下层酒醅出酒的酒质普遍好于上层酒醅出酒的酒质，即池底泥菌群更有利于提高酿酒质量。在酿酒过程中，粮食等原材料经微生物分解代谢形成黄水，黄水沉积在池底，给池底泥带去了丰富的营养和水分。随着黄水水位提高，池底泥和池壁泥中的厌氧菌随着黄水相互流通、相互影响。因此，池壁泥与池底泥菌群的老熟程度差异对酒的品质具有影响。了解池壁泥与池底泥的原核微生物组成差异与理化性质差异，分析两者的关系，有助于分析窖泥老熟的关键因素。

鉴于目前有关池壁泥与池底泥菌群的比较研究很少，安徽省固态发酵工程技术研究中心的张会敏、王艳丽和清华大学化学工程系的邢新会*等人选取安徽省北部某知名浓香型白酒公司的新窖池（5 a窖龄）和老窖池（50 a以上窖龄）的窖泥作为研究对象，对池底泥与池壁泥宏基因组的16S rRNA基因V4区进行Illumina高通量测序，深入分析新老窖池池壁泥与池底泥的理化性质和原核微生物群落结构（包括真细菌和古菌），并建立窖泥理化性质与原核微生物群落之间的冗余相关分析（RDA），分析新老窖池池底泥与池壁泥菌群差异的原因，为综合的窖泥改良提供依据。

1窖泥理化性质

窖泥的理化性质，即窖泥菌群所处的生长环境，对窖泥菌群的生长具有重要作用。结果显示，4组窖泥样本中，BPM_old的pH值最高，WPM_young的pH值最低。与窖泥中的其余有机酸比，乳酸含量最大，且乳酸pKa值最小（3.86），说明乳酸对窖泥的pH值影响最大。通过Pearson相关性分析，证实窖泥中乳酸含量与其pH值的相关性很强。

考虑到乳酸对窖泥pH值的主要影响作用，降解乳酸是提高窖泥质量的重要途径。4组窖泥样本中，BPM_old中的乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯的含量相对较少，而乙酸、己酸的含量相对较多。推测BPM_old中的菌群更倾向于代谢乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯等而生成乙酸和己酸，即浓香型白酒重要香型物质乙酸乙酯和己酸乙酯的前体物质。4组窖泥样本相比，BPM_old的铵态氮含量显著高于其余3组。铵态氮提供微生物生长的氮源，对窖泥菌群的丰度具有重要影响。

推测老窖泥中菌群丰度较高。池底泥中可溶性Ca2＋浓度显著高于池壁泥中的浓度，一方面有可能与白酒发酵过程中形成的黄水（pH 3.2～3.5）沉积在窖池底部与池底泥中的碳酸钙反应有关，另一方面池壁泥与黄水反应形成的可溶性Ca2＋也可能随黄水集中于窖池底部。此外，BPM_old的水分显著高于BPM_young，2组池壁泥的水分不具有显著差异，说明老窖池的池底泥的保水性更好。4组窖泥的理化性质相比，2组池底泥的己酸、K＋和Ca2＋的值比较高且接近，说明池底泥比较适宜己酸菌的生存。新窖池的池壁泥与池底泥相比，池底泥的理化性质更接近老窖泥，也同样说明，池底泥更适宜菌群生存。4组窖泥中，老窖池的池底泥的pH值、铵态氮、己酸、乙酸、K＋的值最高，而丙酸、乳酸、乙醇、己酸乙酯和乳酸乙酯的值最低，反映了老窖池池底泥菌群与环境相互作用的结果。

2 real-time PCR绝对定量结果

Sanger测序显示T-vector中成功插入了长度为189 bp的16S rDNA片段。BLAST结果显示，其与一株uncultured Clostridium sp.具有100%相似性（Accession No.KR704228.1）。提取该质粒作为标准品，通过绝对定量real-time PCR检测窖泥样本中16S rDNA的丰度，结果如图1所示。老窖泥的16S rDNA的拷贝数显著高于新窖泥；新窖池中池底泥的16S rDNA拷贝数略高于池壁泥，不具有显著性差异。本研究的新老窖泥中16S rDNA的拷贝数据与已有研究规律一致。16S rDNA的拷贝数在一定程度上反映了窖泥中原核菌群的丰度。总结来说，与新窖泥相比，老窖泥中的菌群丰度普遍高1～2个数量级。

3窖泥原核微生物群落的α多样性

通过高通量测序，共得到1 030 680条优质序列，平均长度207 bp，平均29 268～49669条/样本。抽平后，得到25 778～25 906条序列/样本。OTU聚类共得到10 935个OTU，平均456个OTU/样本。平均测序覆盖率98.6%，说明测序数目足够代表其菌群组成。序列的注释度（门、纲、目、科、属）＞99.9%，说明窖泥中大量未培养菌实现系统分类。4组窖泥样本中，BPM_old的OTU数目、Shannon指数和Chao1指数值最高，WPM_young最低，与图1结果一致。WPM_old与BPM_young相比，BPM_young中的OTU数目和Chao1指数值更大一些，不具有显著差异；两者Shannon指数值相当，表明两者菌群丰度和多样性相当。WPM_young的丰度和多样性显著低于其余3组，表明池壁泥比池底泥的老熟速度慢。本研究进一步发现了新窖池的池底泥和池壁泥的巨大差异，老窖泥的原核菌群数量（16S rDNA的拷贝数）比较多且未知菌最多，说明了老窖泥菌群的复杂性。

4窖泥原核微生物群落的β多样性

如图2所示，OTU注释共得到25个门，其中23个细菌门，2个古菌门（Euryarchaeota，WSA2）。含量超过0.1%的门有11个。含量最多的门为后壁菌门（Firmicutes）。2组池底泥中Firmicutes的含量相当，BPM_old中含有更多的互养菌门（Synergistetes），BPM_young中含有更多的拟杆菌门（Bacteroidetes）。两组池壁泥相比，新窖池的池壁泥中Firmicutes和变形菌门（Proteobacteria）的含量远多于老窖池的池壁泥，而老窖池的池壁泥中Bacteroidetes、Euryarchaeota和Synergistetes的含量明显更多。Firmicutes、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Synergistetes和Proteobacteria在各组窖泥样本中的含量均不小于1%，为窖泥菌群中的5个优势门，占总测序数的97.7%，占每个样本的94.2%～99.6%。新窖池中，池底泥与池壁泥相比较，池底泥与老窖泥更接近，说明池底泥比池壁泥的老熟速度更快。4组窖泥样本相比较，新窖池池壁泥中的菌群组成最单一。此外，有些菌门，其总序列数小于总测序数的0.01%，为稀有菌门，如螺旋体菌门（Saccharibacteria）和Atribacteria。

OTU注释共得到268个属，总注释度85.82%，其中BPM_old的注释度最低（68.95%），然后依次为WPM_old（86.09%）、BPM_young（89.04%）和WPM_young（99.20%），表明BPM_old的菌群组成最复杂。其余序列被不同程度地注释到门、纲、目、科或者无法被注释。将含量超过1%的属定义为优势菌属，4组窖泥样本的优势菌属组成如图3所示。2组新窖泥相比，WPM_young的菌群组成最单一，其中只有乳酸杆菌属（Lactobacillus，85.59%）和己酸菌属（Caproiciproducens，5.63%），而BPM_young的菌群组成则相对更丰富，其优势菌属组成种类与2组老窖泥无异，说明池底泥的老熟速度更快。不过，BPM_young中Lactobacillus的含量（24.05%）依然显著高于2组老窖泥（9.18%、1.13%）。与目前普遍认为的新窖泥中Lactobacillus的含量更高的结论一致。Caproiciproducens是WPM_young中除了Lactobacillus之外的唯一的优势菌属，推测Caproiciproducens出现在窖泥中比较早。现已证明己酸菌和梭菌等产生的中长链脂肪酸（如己酸）具有抑制Lactobacillus的功能。本实验数据的Pearson相关性分析也证明了Caproiciproducens与Lactobacillus的负相关性。推测随着Caproiciproducens增加，其产生的中长链脂肪酸（己酸、丁酸等）对乳酸菌的抑制作用增强，导致Lactobacillus的优势地位下降，同时老窖泥中降解乳酸的菌属增多，进一步导致了老窖泥中乳酸的减少，进而促进了窖泥pH值升高，逐渐趋于中性，最终有利于噬中性菌属（氨基酸菌Aminobacterium、沉积菌属Sedimentibacter、甲烷菌等）的生长。4组窖泥样本中，BPM_old中Aminobacterium的含量最高（11.85%），其次为WPM_old（2.52%），而2组新窖泥中的含量微乎其微（0.003%～0.55%）。与Aminobacterium相比，沉积菌属（Sedimentibacter）含量稍低，其在老窖泥中的含量也显著高于新窖泥。

窖泥中2种丰度最高的甲烷菌为甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌属（Methanoculleus），前者主要存在于BPM_young中，后者主要存在于BPM_old中。Methanobrevibacter为氢营养型革兰氏阳性菌，以H2、CO2以及甲酸盐为底物生成甲烷。Methanoculleus为氢营养型革兰氏阴性菌，其生长以乙酸作为碳源，可以使用乙醇/仲醇作为电子供体产生甲烷。新老窖池的池底泥中甲烷菌的种类差异有可能与其中代谢功能差异有关。此外，菌属Petrimonas在老窖池的池壁泥（15.58%）和新窖池的池底泥（10.77%）中含量都很高，具有代谢糖类生成乙酸、氢气和CO2的功能，其在BPM_old中含量并不高，也是适应环境的结果。

老窖泥菌群代谢链的完善，促进了环境中乙醇、丁酸、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯含量的减少，同时促进了铵态氮、乙酸和己酸的含量增加。乳酸和乙醇均具有抑菌功能，两者的减少也进一步促进了菌群的繁殖，包括很多未培养菌。综上所述，窖泥菌群所形成的代谢链的功能实际上是代谢窖泥中的有机物质形成己酸的同时，并释放甲烷或者氢气形成厌氧环境的过程。

从图4A可以看到，4组窖泥样本恰好聚类为4组，说明4组窖泥样本中的菌属组成差异明显，老窖池的池底泥与老窖池的池壁泥更相近，其次为新窖池的池底泥，表明窖龄对窖泥老熟更重要，池底泥比池壁泥的老熟速度更快。由图4B可知，4组窖泥样本中，BPM_old组内差异度最小，说明BPM_old均一性比较好，而其余3组窖泥样本内部的异质性比较强。老窖泥菌群一致性好于新窖泥菌群的一致性。将图4A与图4B相比较，可知3组窖泥样本的异质性主要表现在菌属组成的丰度，说明其老熟进度不同。2种聚类结果均表明WPM_young成熟度最低，与成熟度最高的BPM_old之间的聚类距离最远。老窖泥的原核菌群数量（16S rDNA的拷贝数）比较多，且未知菌最多，说明老窖泥菌群的复杂性。

5窖泥理化性质与菌群之间的RDA

图5中箭头的长度代表相关性的大小，中心点和窖泥菌群之间的连线与箭头的夹角，锐角表示窖泥菌群与相应的理化因子呈正相关，钝角表示负相关。2个主成分的总解释度88.10%，主要集中在坐标轴1（78.29%）。以纵轴为分界点，左侧主要为老窖池的窖泥，右侧主要为新窖池的窖泥。个别老窖泥样本出现在右侧，如WPM_o2；几个新窖泥样本出现在左侧，如BPM_y3、BPM_y6、BPM_y4和BPM_y5。BPM_old分布最集中，进一步说明其组内差异很小，均一度比较高，与图4结论一致。使用互动向前选择程序验收理化因子和16S rDNA拷贝数（共16个因素），发现乙酸（32.9%）和水分（20.6%）对相关性的解释度最高，具有极显著贡献（P＜0.01）。乙酸与窖泥原核菌群的强烈相关性；水分与窖泥原核菌群的强烈相关性。参数16S rDNA拷贝数（7.9%）、己酸（7.2%）、乳酸乙酯（6.8%）和己酸乙酯（5.5%）对相关性具有显著贡献（P＜0.05）。其余10个理化因子对相关性的解释度均不具显著性。与BPM_old具有强烈正相关的理化因子为乙酸、pH值和铵态氮，弱相关的理化因子为己酸、Ca2＋、总酯和己酸乙酯。

目前关于新老窖泥菌群差异的研究均表明pH值与优质老窖泥的菌群强烈正相关，乳酸与新窖泥或者退化窖泥的菌群强烈正相关。本研究将池底泥与池壁泥分开研究，发现乙酸和水分与窖泥菌群组成的相关性最强，说明在窖泥菌群老熟进程中，乙酸具有非常重要的作用。一方面，窖泥菌群老熟过程中，有可能缺乏自由水，需要对新窖泥额外补充水分；另一方面，窖泥中乙酸的量可能与促进单纯氢营养型甲烷菌（如Methanobrevibacter）向乙酸营养型甲烷菌（如Methanoculleus）的转变有关。乙酸营养型甲烷菌的存在更有利于乙酸的代谢，促进完整代谢链的形成。

结 论

4组窖泥的理化性质差异明显，其中，老窖池池底泥的pH值、铵态氮、己酸和乙酸值最高，而乳酸、己酸乙酯和乳酸乙酯值最小。4组窖泥的原核菌群结构相比，新窖池池壁泥的菌群组成最单一，其优势菌属仅包括Lactobacillus和Caproiciproducens；老窖池池底泥的原核菌群丰度最高，其中Caproiciproducens、Syntrophomonas、Sedimentibacter、Aminobacterium和甲烷菌属的含量都很高，而老窖池的池底泥中Lactobacillus的含量最低。窖泥理化性质与其原核菌群结构的RDA相关性分析发现，乙酸和水分与窖泥菌群的相关性的解释度最高，表明两者对窖泥菌群老熟具有重要作用。

本文《浓香型白酒新、老窖池池壁泥与池底泥原核菌群结构分析》来源于《食品科学》2020年41卷18期180-187页，作者：张会敏，王艳丽，孟雅静，李安军，周庆伍，胡心行，刘国英，李兰，黄艳，邢新会。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190723-307。