责编 | 酶美
真核生物蛋白质翻译起始需要至少12个翻译起始因子参与，其中两个因子(eIF2和eIF5B)是GTPase，通过不可逆的GTP水解来严格把控起始密码子的识别以及80S翻译起始核糖体复合物的组装。整个翻译起始阶段的动态机理还未研究透彻，目前只有一些相对稳定的中间态被生物化学和结构生物学手段捕捉到，并且其中往往需要使用不能水解的GTP类似物和蛋白因子突变体来将翻译起始因子捕获在核糖体复合物上。
2019年9月，美国斯坦福大学医学院结构生物学系、美国科学院院士Joseph(Jody)D. Puglisi教授团队（王锦繁博士为第一作者）在Nature发表题为“eIF5B gates the transition from translation initiation to elongation”的研究论文，该论文通过体外多色单分子荧光成像(包括smFRET技术)，揭示了酵母蛋白质翻译起始阶段后期80S复合物的组装及其如何过渡到翻译延伸阶段的反应动态机理(详情见BioArt报道：Nature | 王锦繁博士等揭示真核起始因子eIF5B调控翻译起始到延伸过渡的机制)。该文章中的一个重要发现是真核起始因子eIF5B在催化80S复合物组装后会在核糖体上停留相当长的一段时间(20C下大约1分钟)，然而eIF5B从80S复合物上脱离的限速反应步骤尚不清楚。
2020年10月6日，该团队在Nature Communications在线发表题为Structural basis for the transition from translation initiation to elongation by an 80S-eIF5B complex的研究论文（王锦繁博士为第一作者），该研究在上述单分子反应动力学的指导下设计制备了cryoEM样本，成功解析了天然状态下eIF5B结合的80S 翻译起始复合物高分辨率结构，进一步解释了eIF5B在翻译起始阶段后期向翻译延伸过渡中的调控作用机理。
文章作者根据单分子反应动力学实验结果，选择在混合翻译起始所需的蛋白因子、核糖体大小亚基、信使RNA以及起始Met-tRNAiMet后的第40秒将样品迅速冷冻在cryoEM金网上。单颗粒cryoEM分析结果显示，～70%的80S复合物中含有eIF5B，与单分子实验结果估计的～60%接近。研究人员最终获得了整体分辨率2.9的80S-eIF5B复合物结构，该结构清楚的显示eIF5B上GTP已经水解成为GDP，因此限制eIF5B从80S复合物上脱离的反应步骤是eIF5B-GDP的脱离，而不是GTP水解或者Pi释放。该结构还说明了eIF5B在GDP结合状态下是如何通过与Met-tRNAiMet以及核糖体的相互作用来稳定地结合在80S复合物上。通过改变tRNAiMet上所携带的氨基酸或者引入eIF5B单位点突变，单分子实验发现eIF5B结合在80S复合物上的时间可以被显著缩短；酵母体内实验则证明eIF5B过快从80S复合物上脱离会导致反译起始位点选择的准度降低，进一步凸显eIF5B在翻译起始过程中的重要调控作用。该研究还发现了一个真核生物独特的识别tRNAiMet上所携带氨基酸的机制，并描述了在这个向翻译延伸过渡的复合物中Met-tRNAiMet是如何与信使RNA上起始密码子相互识别。
总之，这篇文章向我们呈现了一个成功地利用单分子反应动力学结果指导cryoEM实验设计的案例。
https://www.nature.com/articles/s41467-020-18829-3
制版人：嘉
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