老掉牙的改性PCL骨修复发《自然·材料》，有这么简单？

　　近年来,由疾病、外部创伤等原因引起的骨缺损一直是研究热点和产业热点。上市的产品不胜枚举，在功能上也是各有千秋。所以想在如此成熟的领域再有所斩获，推陈出新，甚至将其发表在《Nature Materials》，难度可见一斑。

　　骨缺损处需要大量的填充物。根据 经典的 组织工程三要素理论设计的填充支架存在一个重大挑战就是种子细胞植入体内后存活率低，这严重影响了其修复再生的能力。那能不能给细胞打打鸡血？安心骨修复呢？

　　伦敦国王学院干细胞和再生医学中心的研究团队近日报道了 一种新型骨修复绷带，以生物可降解的聚己内酯(PCL)作为绷带基材，通过调控Wnt信号通路，实现人骨骼干细胞（hSSCs）长期（＞8周）存活能力。 在大鼠颅骨缺损模型中，经修复后的新形成的骨在结构上可与成熟的皮质骨相媲美，并由人（人的细胞由修复绷带负载植入的）和鼠细胞组成。 该研究精巧地在修复绷带上设计了一种包含三维Wnt诱导成骨组织模型(WIOTM)，介导人骨骼干细胞不对称分裂，同时产生Wnt-近端骨骼肌干细胞和易于分化的Wnt-远端细胞，促进骨修复。

　　Wnt3a诱导细胞不对称分裂，成骨基因差异化表达

　　根据作者前期研究，发现在 Wnt3a蛋白的刺激下，大约53%的骨骼肌干细胞激活了Wnt /β连环蛋白通路（ Wnt/β-Catenin通路调节干细胞的多能性，并且在发育过程中决定细胞的分化命运）。 有意思的是，与固定化的Wnt3a不同，在可溶性的培养基中加入Wnt3a蛋白可诱导hSSC增殖，但是不促进细胞迁移。 研究人员进而探究 ，细胞的分裂方向与多层形成是否由Wnt3a在hSSCs一侧的不对称呈现耦合和调控的（图2b，Wnt3a表面上可能的细胞分裂模式的三维图示）。 研究人员在 Wnt3a平台上低密度培养 hSSCs，并在成骨培养基中加入COL1-gel，利用三维成像显示了hSSCs中期有丝分裂的方向，发现存在两类分裂方式的细胞。其一，垂直于Wnt3a平台且在花状染色质环的中期排列染色体的细胞 （图1 d, e）；其二，平行于Wnt3a平台分裂的细胞，其染色质环立在边缘，从上面看是一个长方形。与此同时，与未被激活Wnt/β-Catenin通路的细胞相比，作者观察到垂直于Wnt3a平台分裂的细胞比例显著增加（图1c）。 除了分裂方式不同，在垂直于Wnt3a -平台的分裂中，作者发现腺瘤性结肠息肉病蛋白APC、极性蛋白非典型激酶Cζ（纺锤体定向通常需要将极性蛋白不典型蛋白激酶Cζ(aPKCζ)划分到细胞的一侧）和连环蛋白catenin主要定位于Wnt3a -近端细胞(图1d-g,l)。在平行分裂中，这些蛋白在细胞的两半中分布相似 (图. 1d,g,l)。

　　在相关基因表达上，最近发现的hSSC标记物CDH13和PLXNA2在 Wnt3a -近端细胞中高表达，在远离Wnt3a -平台的细胞中下调 （图2 a,b,c）。然而成骨基因OCN和OPN在Wnt3a -远端细胞中高表达（图2 d,f）。在平行于wnt3a平台分裂的细胞中，分裂的细胞对之间的干细胞和分化标志物分布是一致的（图2e,f,i–k）。

　　因此作者认为，在以Wnt3a介导的单个hSSCs分裂过程中，定位的Wnt3a诱导Wnt3a近端-细胞中干细胞命运标记物的富集，诱导Wnt3a-远端细胞的早期成骨分化标志物富集。

　　图1所示。定位的Wnt3a诱导骨骼干细胞不对称分裂。

　　图2所示。定位的Wnt3a诱导细胞命运标记物在分裂细胞中不对称分布。

　　生物降解Wnt3a绷带的制作，验证骨修复能力

　　为了将诱导成骨模型（WIOTM，Wnt3a诱导骨骼干细胞所形成的成骨模型）移植到体内，研究人员设计了一种结合Wnt3a蛋白生物相容性绷带，用于移植移植细胞。他们使用临床认可的聚己内酯(PCL)聚合物薄膜，经过氧等离子体处理表面，然后用氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)孵育)。 (O2/APTES)为Wnt3a共轭提供了伯胺官能团。重要的是，支架上的伯胺官能团在室温下可保持8周稳定性。纯化的Wnt3a蛋白通过戊二醛共价结合到胺基上。

　　研究人员制备出骨修复绷带后，首先用western blot分析验证了Wnt3a成功地共价结合到了PCL绷带上(图3 a)。同时为了验证结合后的 Wnt3a活性，作者又进行了TCF-荧光素酶报告细胞系(LS/L)测定（TCF是β-catenin通路激活的一个标志性效应因子），显示共价结合后的 Wnt3a保持了极高的激活β连环蛋白途径的能力(图3 b)。为了验证hSSCs的活性，作者将具有7xTCF-eGFP//SV40- mCherry基因的hSSCs种植在了Wnt3a绷带上，结果显示，接枝了20或60 ng Wnt3a的Wnt3a-PCL的hSSCs显示eGFP表达的增强呈剂量依赖性，而iWnt3a-PCL和牛血清白蛋白-PCL (BSA-PCL)对照显示eGFP的基础水平表达(图3c,d)。eGFP表达受7xTCF结合位点控制，mCherry显示红色荧光，在细胞中是组成性共表达。

　　图3。Wnt3a -绷带的体外功能研究

　　研究人员以大鼠颅骨缺损为模型，验证绷带的体内修复的效果。植入修复八周后，微型计算机断层扫描(CT)分析结果显示，由Wnt3a绷带覆盖的缺损部位表现出明显的新骨形成，而 WIOTM绷带组表现出更多的骨形成，为Wnt3a绷带组的近两倍(图 4c,d)。组织学染色评价表明， WIOTM绷带组的缺损部位新形成的骨矿化区域显示了健康骨的组织学特征，其中核被拉长且稀疏分布，此外，周围的钙化组织呈现条纹，这是板层骨的特征(图4e,f)。连接缺损的结缔组织/间质样组织显示出密集的细胞核(图4e)。在Wnt3a和WIOTM绷带组处理的缺损中，缺损部位中段和缺损边缘均有新骨形成，表明在修复和再生过程中，新骨与已有骨融合(图4e)。新形成的骨内血管也被检测到(图4f)。

　　图4。Wnt3a和WIOTM绷带在修复骨缺损中的体内功能评价。

　　小结

　　最后，研究者得出结论，接枝了Wnt3a的修复绷带打破了细胞分裂过程的对称性，使hSSCs分裂形成富集早期成骨分化基因的Wnt3a -远端细胞和富集了连环蛋白、APC、细胞极性蛋白aPKC和干细胞标记物的Wnt3a -近端细胞。该种设计，即WIOTM绷带，能同时维持损伤部位的人的hSSCs和成骨细胞，加速骨修复。植入体内后显示出了极佳的骨修复效果。

　　该研究成果以题为“Wnt-modified materials mediate asymmetric stem cell division to direct human osteogenic tissue formation for bone repair”的论文发表在《 Nature Materials 》上（见文后原文链接）。文章第一作者为Yoshihisa Okuchi，通讯作者为伦敦国王学院干细胞和再生医学中心的 Shukry J. Habib教授。

　　全文链接：

　　https://www.nature.com/articles/s41563-020-0786-5#Sec32

　　来源：高分子科学前沿

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