黑曲霉固态发酵对甘蔗叶酚类物质释放及抗氧化活性的影响

植物多酚是植物中具有多个酚羟基结构的化合物的总称，通常分为可溶性多酚与不可溶性-结合态多酚，其中可溶性多酚易于用有机溶剂直接提取，结合态多酚类通常与植物细胞壁中的纤维素、蛋白质、木质素、糖基、有机酸结合成共价复合物而难以提取。

近年来，微生物固态发酵技术逐渐应用于植物酚类物质提取研究中，通过微生物发酵产生的复合酶系（纤维素水解酶、木质素水解酶和果胶水解酶等）的水解作用，破坏细胞壁纤维成分的致密结构或者切除多酚物质与其他物质之间交联的共价键，从而促进酚类物质的释放和转化，进而影响其生物活性的变化。有学者利用黑曲霉和少孢根霉固态发酵果汁加工后副产品果渣，发酵后果渣中多酚、黄酮的含量有较大增加，自由基清除活性显著上升。

甘蔗叶是甘蔗制糖产业中主要的副产品，产量非常大。研究表明，甘蔗叶中含有一定量的酚类物质，主要是黄酮、酚酸类，在不同甘蔗品种（系）叶片中含量差异较大，大致在0.5%～2%范围内，具有抗氧化、抗突变、抗炎、降血糖等生理功能。但甘蔗叶中大部分酚酸都以结合态的形式存在，为更有效提取甘蔗叶中的酚类物质，广西大学生命科学与技术学院的阎欲晓、粟桂娇和何勇强利用黑曲霉对甘蔗叶进行固态发酵，探讨发酵过程对甘蔗叶中多酚、黄酮的释放及抗氧化性能的影响，旨在为甘蔗叶的深度开发利用提供理论支持。

1 单因素试验结果

1.1 接种量对发酵甘蔗叶多酚、黄酮含量的影响

从图1可以看出，经不同接种量的黑曲霉发酵处理3 d后，发酵甘蔗叶中黄酮和多酚的释放量均显著高于对照组（P＜0.05）。在接种量为7～28 mL/100 g的范围内，黄酮和多酚含量随接种量的增加而提高，当接种量为28 mL/100 g时黄酮和多酚释放量均达到最高，分别为9.65 mg/g和9.47 mg/g，而接种量增加至35 mL/100 g时，黄酮和多酚的释放量反而有所下降。原因可能是当接种量过大时，培养基中营养物质不能满足菌体生长需要，一些酚类化合物被微生物当作碳源利用。

1.2 培养基含水量对发酵甘蔗叶多酚、黄酮含量的影响

由图2可知，当培养基含水量为40%时，由于基质中的自由水不足以维持黑曲霉菌体生长所需，进而影响细胞代谢，导致黄酮、多酚的释放量较低；而含水量达到70%时，培养基出现结块，传质困难，也影响了发酵效果。当含水量为50%时黄酮释放效果最好，达到9.90 mg/g，含水量为60%时多酚含量达到最大，为10.35 mg/g。

1.3 发酵时间对发酵甘蔗叶多酚、黄酮含量的影响

从图3可以看出，与对照组相比，甘蔗叶经过黑曲霉发酵处理的2～6 d内，黄酮和多酚含量逐渐增高，且均比未发酵对照组有显著提高（P＜0.05）。其中在第3～5天酚类物质均保持较高含量，变化幅度不大，但第6天后，黄酮和多酚含量则显著下降（P＜0.05）。

2 正交试验优化发酵条件

结果显示，发酵时间在各个水平上有显著差异，但培养基含水量和接种量的水平差异不显著。以黄酮含量为指标，优化后的发酵最佳工艺为接种量28 mL/100 g、培养基含水量60%、发酵时间5 d；以多酚含量为指标，最佳条件为接种量35 mL/100 g、培养基含水量50%、发酵时间4 d。

根据3 个因素的极差大小以及表3方差分析的显著性差异情况，综合考虑，选择接种量28 mL/100 g、培养基含水量50%、发酵时间5 d，测得发酵甘蔗叶中黄酮含量为13.82 mg/g，多酚含量为10.40 mg/g，比未发酵甘蔗叶中可溶性黄酮和多酚含量分别提高了135%和92%（P＜0.05）。

3 甘蔗叶发酵过程中相关水解酶活力的变化与酚类物质释放的关系

3.1 发酵过程中水解酶活力的变化

为阐明甘蔗叶发酵过程中，黑曲霉产生的 相关碳水化合物水解酶与甘蔗叶多酚、黄酮释放的关系，对发酵过程中产生的纤维素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力进行了跟踪测定，结果如图4所示。黑曲霉固态发酵过程中能够产生一定量的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，而且纤维素酶活力明显比β-葡萄糖苷酶活力高，2 种水解酶活力均呈现先增加后降低的变化趋势。纤维素酶活力在发酵第4天达到最大值，为632.17 U/g，β-葡萄糖苷酶活力在发酵第5天时达到了顶峰，为75.02 U/g，随后活力显著下降。与图3进行比较可知，发酵过程中产生的水解酶系与酚类物质释放的变化趋势基本保持一致，均是在发酵第4～5天，产量达到最大，进一步说明甘蔗叶酚类物质的释放与微生物发酵过程中产生的水解酶系有密切的关系。

3.2 酚类物质释放量与酶活力变化的相关性分析

为进一步探究黑曲霉发酵甘蔗叶的过程中酚类物质含量与纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活力的关系，分别以黑曲霉发酵后甘蔗叶多酚和黄酮含量为横坐标，以两种酶活力为纵坐标，检验酚类物质的释放量与酶活力变化的相关性。

结果显示，酚类物质的释放量与纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活力呈显著正相关。其中多酚和黄酮含量与纤维素酶活力的相关系数R2分别为0.856 3和0.678 9，与β-葡萄糖苷酶活力的相关系数R2分别为0.510 0和0.622 6，说明酶活力越强，越有利于甘蔗叶中酚类物质的释放。分析原因，首先纤维素酶破坏甘蔗叶细胞壁纤维素的致密结构，有助于暴露出酚类物质与其他物质之间结合的化学键，然后纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶系断裂结合态多酚与植物纤维素、半纤维素、木质素以及一些多糖结构连接的共价键，释放出甘蔗叶中结合态酚类物质，从而使可溶性酚类物质含量增加。

4 抗氧化能力

从图6可知，在一定质量浓度范围内，甘蔗叶提取液中黄酮与羟自由基清除率有良好的量效关系，清除率随黄酮质量浓度的增大而上升。发酵甘蔗叶提取液黄酮质量浓度在200 μg/mL和400 μg/mL时，羟自由基清除率分别为29.61%和91.73%，其IC50值为268.93 μg/mL；而未发酵甘蔗叶黄酮质量浓度在270 μg/mL和450 μg/mL时，羟自由基清除率仅为18.18%和82.78%，IC50值为366.06 μg/mL，说明经过黑曲霉发酵后的甘蔗叶提取液具有较强的羟自由基清除能力，但低于对照组VC（IC50=158.34 μg/mL）。

图7 显示，发酵甘蔗叶提取液中黄酮对DPPH自由基清除能力（IC50=21.25 μg/mL）和对照组VC的清除能力差别不大（IC50=20.13 μg/mL），而且明显强于未发酵甘蔗叶（IC50=39.44 μg/mL），在黄酮质量浓度为40 μg/mL时，发酵甘蔗叶的DPPH自由基清除率达到了79.18%，而未发酵甘蔗叶在黄酮质量浓度为45 μg/mL时，清除率仅为54.01%。

结 论

利用黑曲霉对甘蔗叶进行固态发酵，经60%乙醇溶液提取后，提取液中多酚含量和黄酮含量均比未发酵甘蔗叶样品显著上升。在接种量28 mL/100 g、培养基含水量50%、发酵时间5 d条件下，甘蔗叶中黄酮和多酚含量分别为13.82 mg/g和10.40 mg/g，比未发酵甘蔗叶中可溶性黄酮和多酚含量提高了135%和92%（P＜0.05）。

测定发酵过程中微生物代谢产生的纤维素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力的变化，发现这2 种水解酶活力均呈现先增加后降低的变化趋势，而且酶活力的变化趋势与酚类物质（黄酮、多酚）含量的变化趋势基本一致；通过相关性分析可知，发酵过程中酚类物质的释放量与纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活力呈良好正相关，说明甘蔗叶酚类物质的释放与微生物发酵过程中产生的水解酶系有密切关系。

发酵前后的甘蔗叶黄酮提取液均对自由基具有一定的清除能力，但发酵后甘蔗叶黄酮提取液对DPPH自由基和羟自由基清除能力均比发酵前有明显提高。

本文《黑曲霉固态发酵对甘蔗叶酚类物质释放及抗氧化活性的影响》来源于《食品科学》2020年41卷16期110-116页，作者：阎欲晓，粟桂娇，何勇强。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190703-033。

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