Cell Metab | 刘时昱等定量分析生理状态下血糖对小鼠不同器官的能量贡献

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细胞从外界环境中摄取营养，进行新陈代谢，产生生命活动所必需的物质和能量。不同的细胞对于营养的偏好不同，对其精确的观察和测量对我们理解纷繁复杂的生命现象至关重要，同时异常的营养偏好往往与多种疾病紧密相关，如癌细胞中常见的温伯格效应（Warburg effect，即癌细胞极度依赖于葡萄糖经糖酵解所产生的能量，而正常体细胞主要依赖于三羧酸循环所产生的能量）。生理状态下细胞的能量来源多样，可能是葡萄糖、乳酸、脂肪酸、氨基酸等等，其受机体状态、组织类型、遗传背景和环境的影响较大，且较难在生理状态下准确测量，因此在有机体内各个组织器官的能量来源一直以来都没有确定性的结论。

随着质谱和核磁共振技术的发展，依赖于稳定同位素标记的代谢流分析（Metabolic Flux Analysis,MFA）方法逐步成熟：细胞或动物摄入经过稳定同位素标记的化学物质，如葡萄糖，一段时间后体内各种代谢物会混有一定比例的同位素，在反应速率恒定的假设下，根据各个代谢物中同位素的比例可以推断出各个生化反应的速率。该方法可以在几乎不干扰正常生化反应的前提下精确测量多个反应速率，非常有利于研究生理状态下的代谢过程。然而先前这种分析方法往往仅被应用在细胞层面，且其结果缺乏严格的统计学检验和敏感性分析，因此往往只作为一个辅助手段来使用。

2020年9月21日，美国杜克大学Jason Locasale课题组（博士生刘时昱为第一作者，戴紫薇博士为第二作者，Locasale博士为通讯作者）在Cell Metabolism杂志上发表文章Quantitative Analysis of the Physiological Contributions of Glucose to the TCA Cycle，该研究构建了一套严格的代谢流分析（MFA）方法，建立了包含多个组织器官的代谢模型，拟合了同位素灌流小鼠中多个器官的代谢物同位素含量数据，利用拟合的结果分析了生理状态下多个组织器官的能量来源。证明大多数情况下对于除肝脏和肾脏以外的器官，葡萄糖依然是细胞主要的能量来源。

对于大多数哺乳动物，饥饿状态下往往是肝脏通过糖原分解和糖异生等手段为其他器官维持血糖浓度（图1A），该研究团队首先构建了一个包含三种组织的代谢流模型（图1B）：一种为包含外源葡萄糖补充的源组织（Source Tissue，模拟肝脏），另一种为无葡萄糖补充的汇组织（Sink Tissue，模拟其他器官），加上允许葡萄糖和乳酸交换的血浆（Plasma），借此模拟体内各种器官通过血液交换代谢物的状态。同时，该研究的数据源自碳-13标记的葡萄糖或乳酸灌流小鼠主静脉，采集其各个器官和血样之后，使用高效液相色谱-质谱联合分析各个代谢产物中包含不同数量碳-13原子的比例分布（Mass Isotopomer Distribution, MID）（图1C）。围绕该模型，该研究组改进了MFA方法，在原本的预测-与实验数据对比-改进预测的迭代优化基础上，添加了Sample的环节，即在模型的多个子空间内搜索优化，并将所有拟合效果较好的结果都作为可行解使用（图1D, E）。

图1 MFA的完整流程

根据代谢流模型的解可以计算出血浆中的葡萄糖和乳酸分别对于源组织和汇组织三羧酸循环的净贡献流（图2A）。因为源组织自身有外源的葡萄糖补充，对汇组织的贡献流更能反映出组织器官对于循环系统中代谢物的依赖程度，因此这里选取对汇组织的贡献流用于计算葡萄糖的相对贡献比例，当这个比例高于0.5时可以认为葡萄糖是该汇组织的主要能量来源，反之可以认为乳酸是主要能量来源（图2B）。为了更全面地反映葡萄糖的贡献，所有拟合效果较好的可行解都被用来计算相对贡献率，最终就形成了贡献率的分布（图2C）。根据这一套分析方法，该研究拟合了之前已经发表的一组小鼠中的同位素灌流数据 (Hui et al., 2017)，分别以碳-13标记的葡萄糖或乳酸灌流小鼠，以肝脏作为源组织，分别以心脏、大脑、骨骼肌、肾脏、肺、胰腺、小肠和脾脏共八种器官作为汇组织，发现总体上在除肾脏和胰腺以外的大部分汇组织中，葡萄糖对三羧酸循环的贡献都远大于乳酸（图2D-K）。

图2 葡萄糖和乳酸贡献率的定义，以及对之前发表的研究数据进行拟合，发现大多数情况下葡萄糖对三羧酸循环的贡献率远高于乳酸。

值得注意的是，该结论依赖于不少实验测量的参数。为了更好地验证结论的可靠性，该研究还对所依赖的参数和数据进行了敏感性分析。该模型的结果主要依赖于三个参数：血浆中葡萄糖和乳酸的周转速率以及源组织中外源葡萄糖的补充速率。参数敏感性分析中，分别对三个参数和所使用的代谢物MID数据进行随机扰动并计算葡萄糖贡献率的分布，收集不同扰动所得贡献率分布的中位数，可绘制出不同扰动下中位数的分布图（图3A）。分析发现贡献率分布的中位数对于葡萄糖的周转速率和源组织中的补充速率不敏感，而对于乳酸的周转速率和代谢物MID数据相对比较敏感，但绝大多数扰动下葡萄糖贡献率依然非常接近100%（图3B-E）。

图3 对模型的参数敏感性分析

以上分析结果的数据均来源于之前已发表的结果 (Hui et al., 2017)。为了确保结论的普适性，该研究组灌流并采集了另一种基因背景的小鼠的数据。与之前发表的结果相比，该实验组给予了更大灌流流量和更长灌流时间（图4A）。方便起见称新数据为高灌流数据，而之前发表的数据为低灌流数据。监测数据表明灌流全过程中血液中葡萄糖、乳酸和胰岛素的浓度无显著升高（图4B）。在这个新的实验条件下，灌流流量相对内源的葡萄糖流量已不可忽视，因此模型中的血浆里添加了新的输入流（图4C）。新的高灌流数据包含四只小鼠，源组织依然为肝脏，而汇组织为骨骼肌。四只小鼠的数据对该模型拟合后损失函数均远低于非拟合的随机对照组（图4D）。经计算后在大多数高灌流组小鼠中，血浆中葡萄糖对于汇组织三羧酸循环的贡献率依然远高于乳酸（图4E, F）。

图4 高灌流实验数据、模型及分析结果。

虽然考虑了多组织的相互作用，但目前所有模型中源组织和汇组织均只有一种，而有机体内往往有多种源和汇组织。为了验证该模型在组织类型上的可扩展性，该研究在原模型的基础上再添加了另一个汇组织，使整个模型变得更加复杂（图5A, B）。同时对于葡萄糖相对贡献的定义也随之扩展，最终的相对贡献被定义为两个汇组织中葡萄糖的净贡献流总和所占比例（图5C）。使用低灌流数据拟合该模型，源组织依然为肝脏，而汇组织是心脏、大脑和骨骼肌的不同组合。在三种组合中，葡萄糖的相对贡献均高于乳酸（图5D）。因此，在考虑更多汇组织的情况，血浆中的葡萄糖依然是汇组织中三羧酸循环的主要来源。

图5 拥有多个汇组织的模型及分析结果。

完整的有机体内除了多种组织相互作用以外，组织也会和血液交换多种代谢物。除了葡萄糖和乳酸，血液中周转率较高的代谢物还包括丙酮酸、乙酸、丙氨酸等物质 (Hui et al., 2017)，因此验证模型中血液循环中代谢产物的可扩展性也尤为重要。该研究在原模型的基础上添加了丙酮酸作为第三种循环代谢物，使源和汇组织可以和血浆交换丙酮酸。同时考虑到红细胞可以进行糖酵解过程，新模型还添加了血液中葡萄糖-丙酮酸-乳酸的转化（图6A, B）。因为新模型有三种循环代谢物来源，每种循环代谢物的相对贡献被定义为汇组织中该代谢物净贡献流占三种循环代谢物总净贡献流的比例，三种贡献率总和为1（图6C）。最终的贡献率分布以三元图的形式展示，颜色越深表示该点在所有可行解中出现概率越大，同时所有可行解的均值点也被标在图上。分别使用低灌流和高灌流的数据拟合模型，源组织均为肝脏，而汇组织在低灌流数据中为心脏，在高灌流数据中为骨骼肌。结果可见，低灌流数据中，葡萄糖的相对贡献率最高，在80%左右，丙酮酸大约在10%左右；而乳酸最小，几乎无贡献（图6D）。而在高灌流数据中，丙酮酸和乳酸的贡献均可忽略，汇组织中所有三羧酸循环几乎均来源于葡萄糖（图6E）。因此，在考虑更多代谢物的情况下，血浆中的葡萄糖依然是汇组织中三羧酸循环的主要来源。

图6 拥有多个循环代谢物的模型及分析结果。

该研究最大的特点是建立起了一套利用MFA研究有机体生理条件下代谢问题的标准范式，如对解空间的大量子空间分别Sample和对参数敏感性的分析，这些操作对于结论的可靠性都尤为重要。同时其模型的可扩展性极高，组织内的模型完全可以扩展为包含多个代谢通路的复杂模型，源和汇组织也可扩展为多个，同时血液可以容许更多循环代谢物进行交换，以模拟更多更复杂的组织器官间的相互作用。当然，在这种情况下很可能出现约束不足、自由度过大的情况，需要考虑更多的约束以及更好的Sample方式，从而更全面反映出代谢流网络的性质，以更好地回答生理状态下有关代谢的生物学问题。

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.09.005

制版人：十一

参考文献

Hui, S., Ghergurovich, J.M., Morscher, R.J., Jang, C., Teng, X., Lu, W., Esparza, L.A., Reya, T., Le, Z., Yanxiang Guo, J., et al. (2017). Glucose feeds the TCA cycle via circulating lactate.Nature551, 115-118.