RNA，一度被认为仅存在于细胞内，但现在我们已经知道RNA在细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的保护下遍及全身。如今，对细胞外RNA（extracellular RNA，exRNA）的研究正在悄悄地引发一场生物学革命，越来越多的科学家致力于了解细胞为何又如何释放RNA，以及exRNA在检测和治疗疾病中的潜力。
近日，南京大学生命科学院院长张辰宇教授受国际顶尖学术期刊 Nature 杂志邀请，组织了题为《Extracellular RNA》的系列文章，系统报道了细胞外RNA领域最受关注和最前沿的研究。系列文章以增刊形式（Nature Outlook）发表。
其中张辰宇教授发表了Nanjing School: Extracellular microRNA mediates co-evolution between species （南京学派：细胞外miRNA介导物种之间的共同进化）的Highlight文章。
“监听”exRNA编码的细胞间通讯有望揭示癌症等疾病的早期信号。目前也有多项研究正在开发能够追踪体液中这些细胞外片段的方法。在疾病治疗方面，携带RNA的囊泡有望在治疗心血管、神经系统和免疫系统疾病时替代干细胞疗法，成为更安全也更简便的治疗选择。
值得一提的是，研究人员正在探索如何让携带RNA的囊泡穿过血脑屏障，来递送治疗药物。相比关注度更高的人造纳米颗粒，这些天然囊泡具有更多优势。
除了潜在的临床应用，exRNA可能还对饮食有着神秘影响。南京大学张辰宇教授团队的一系列研究发现，我们所吃食物的的RNA对人体基因表达存在某种调控关系。此后，大量研究开始探索我们的食物与身体之间的“交流”。也有研究在观察母乳中的RNA对婴儿健康的影响。
对于植物科学来说，由于我们对exRNA的生物学意义更清晰的认识 ，研究人员得以通过遗传修饰来增强作物的抗病害能力。
在过去十多年里，由南京大学张辰宇教授领衔的南京大学生科院研究团队，专注于细胞外miRNA研究。
2008年，张辰宇团队在 Cell Research 杂志发表关于miRNA可在人类和动物的血清和血浆中稳定存在的原创发现【1】。该研究开创了细胞外RNA研究的新领域，也成为所有血清miRNA生物标志物研究的基础。截至目前，pubmed显示该论文被引用1529次，谷歌学术显示被引用4531次，成为中国学者被引用数量最多的论文（之一）。
BioWorld特别梳理了以张辰宇教授为代表的南京学派（Nanjing School）关于细胞外miRNA的系列研究进展。
核酸研究可分为三个历史性阶段，其中前两个阶段属于细胞内时代，第三个阶段则属于细胞外时代。
第一阶段：在这一阶段，人们已了解到DNA和RNA携带遗传信息，但它们被认为缺乏任何进一步的生物学功能。
第二阶段：在这一阶段，随着核酶、siRNA和miRNA的发现，表明RNA可以具有类似蛋白质的功能，但人们仍然认为RNA局限于细胞内环境。
第三阶段：张辰宇团队于2008年发现血清和血浆中稳定存在miRNA，随后还发现植物性食物和中药汤剂中的植物miRNA可跨界调控人体基因表达，这些发现表明，miRNA在细胞外同样具有生物学功能。
2008年，张辰宇团队在在 Cell Research 杂志发表关于miRNA可在人类和动物的血清和血浆中稳定存在的原创发现【1】，该研究使用深度测序对人血清中的miRNA谱进行了表征，并确定了独特的血清miRNA模式，从而将癌症和糖尿病患者与健康受试者区分开。这些发现表明，特定的血清miRNA谱可作为疾病诊断标志物。
同年，弗雷德·哈钦森癌症研究中心Muneesh Tewari等人在 PNAS 发表论文，将血浆miRNAs确定为前列腺癌的有前途的生物标志物【2】。
这些研究挑战了RNA在含有降解RNA的核酸酶的细胞外环境中不稳定的经典观点。此后，越来越多的证据表明，miRNA在包括唾液，尿液和母乳在内的细胞外生物体液中以稳定、无细胞形式循环，由于细胞外miRNA与癌症和糖尿病等疾病紧密相关，因此细胞外miRNA有潜力成为疾病诊断的生物标志物。
尽管细胞外环境中存在降解RNA的核酸酶，但细胞外miRNA在体液中循环的发现表明存在保护miRNA免受降解的机制。
南京学派的一些列工作研究了细胞外囊泡（EV）是否可以作为保护miRNA在细胞外环境中不被降解的屏障。
张辰宇团队研究发现，循环血浆中的大多数miRNA都存在于血浆的外泌体（Exosome）和微泡（Microvesicles）中，而不是无细胞外囊泡的血浆中【3】。
进一步地，张辰宇团队提出了两种模型【4】来解释细胞外miRNA的稳定性：（i）EV膜结构对miRNA的保护；（ii）通过形成蛋白质-miRNA复合物来稳定miRNA。
此外，张辰宇团队还提出了细胞外miRNA产生的三种主要途径：（i）EV以能量依赖的选择性过程主动分泌；（ii）与RNA结合蛋白结合，从供体细胞释放；（iii）由于组织损伤、细胞凋亡或坏死而从破碎或损坏的细胞中被动分泌。
分泌到细胞外的miRNA可以靶向多个基因，从而影响特定的靶细胞。张辰宇团队在Cell Research 的一项研究表明，肿瘤细胞分泌的miRNA可导致肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤细胞增殖【5】。
这些研究表明，异常分泌的miRNA可能导致细胞功能障碍和疾病，预示着我们对细胞间信号转移的理解进入新时代。
张辰宇团队的一个研究重点是miRNA是否可以在远缘的复杂生物之间转移，如果可以，那么miRNA是否可以促进物种之间的串扰（crosstalk）?
人类几乎每天都在食用诸如谷物、蔬菜和水果等植物性食品，研究团队假设外源性植物miRNA可以承受胃酸和胃肠道中的消化酶并进入组织中。
2011年，张辰宇团队在 Cell Research 杂志发表论文【6】，该研究通过人血清中全部miRNA表达谱，发现外源植物miRNA在中国健康男性和女性的血清中一直存在。其中MIR156a和MIR168a显示出相当程度的表达。
进一步的体外和体内分析首次证实，食物来源的外源植物MIR168a可以通过小鼠胃肠途径并进入循环和各种器官，特别是在肝脏中跨物种调节小鼠LDLRAP1蛋白表达。
这项研究首次表明，食物中的外源植物miRNA可以调控哺乳动物靶基因的表达。
在许多国家，都有“You are what you eat”的俗语，人如其食，以食物赋予健康为基础，张辰宇团队正致力于研究食用植物可以给人类带来益处的生物学机制。
从进化的角度来看，miRNA的跨物种转移在促进远缘物种串扰、交流和信号传播方面具有独特的地位。
2017年，南京大学生命科学院陈熹团队在 PLOS Genetics 杂志发表研究论文【7】。
该研究颠覆性发现，蜂粮里的植物miRNA通过抑制蜜蜂幼蜂的卵巢和整体的生长发育，使之成为工蜂。而蜂王浆中不含有植物miRNA，因此吃到蜂王浆的幼蜂则发育为蜂王。这与之前认为蜂王浆中含有特殊有益物质让幼蜂发育成蜂王的认识恰好相反。
更重要的是，这项研究提示了蜜蜂和开花植物之间以共同进化的关系向彼此施加选择性压力，从而影响相互连接的生态系统中的彼此命运。
考虑到物种经历了数百万年的共同进化以形成我们今天生活的生态系统，跨界miRNA转移可能在自然界中很常见。实际上，越来越多的证据表明，miRNA可以跨越物种（Species）甚至界（Kingdom）以传播基因沉默信号，从而充当连接动物、植物和微生物界的纽带。
中国传统医学，特别是中草药，在中国用于治疗和预防疾病已有数千年的历史了。但是，由于缺少在随机对照临床试验中进行严格的测试，因此中医中采用的许多理论和实践在科学上并未得到证实。
一些研究将中草药的作用归因于次级代谢产物和小分子物质。往往没有考虑大分子物质，例如RNA。
RNA被认为不能在胃肠道中稳定存在，并且中草药往往需要在水中煮沸数小时以产生水煎剂，因此通常认为RNA在制备过程中会降解。 因此，对中草药汤剂的科学研究常常将RNA从生物活性成分中排除了。
2014年，张辰宇团队在 Cell Research 发表研究论文【8】。中医中被广泛用于治疗流感的金银花，其编码的MIR2911，由于高GC含量和特殊序列，能够在煮沸后的金银花汤剂中仍能完整保留，体外细胞实验表明，MIR2911可以靶向并抑制甲型流感病毒的多个病毒基因。
小鼠实验则表明，饲喂金银花汤剂的小鼠血液和肺中MIR2911显著升高，且MIR2911抑制了各种甲流病毒（包括H1N1，H5N1和H7N9）在小鼠体内的复制，减轻了病毒感染引起的体重减轻，并降低了小鼠死亡率。
该研究提供了第一个证据，证明植物miRNA可能是中药中的活性成分，并确定了首个有助于抑制病毒感染的植物miRNA。
新冠病毒（SARS-CoV-2）大流行再次强调了病毒对公共健康构成的威胁。而且病毒可以迅速突变，这意味着研发有效的疫苗可能是一个挑战。因此，开发广谱抗病毒药物可以帮助为将来的疫情暴发做好准备。富含MIR2911和MIR2911的金银花汤剂可能是抑制病毒感染的潜在治疗策略。
基础研究的最终目标是将新发现转化为实际应用。从这个角度来看，miRNA在细胞外环境中的稳定存在激发了三个重要的研究方向：
i）细胞外miRNA具有作为疾病诊断生物标志物的潜力；
ii）细胞外囊泡封装的miRNA具有基于RNAi的基因治疗的潜力；
iii）基因改造食用植物以生物合成miRNA作为药物，具有直接通过食用进行基因治疗的潜力。
RNAi技术自诞生以来就被寄予厚望，但缺乏安全有效的递送系统阻碍了其临床应用。
为解决RNAi疗法的递送难题，张辰宇团队探索了细胞外囊泡（EV）作为小RNA递送载体的潜力。研究团队通过招募人体自己的细胞外囊泡作为RNA转运系统，这样内源性细胞分泌的天然囊泡，既可以保护小RNA跨细胞和生物屏障运输，还具有很好的生物相容性。
2014年5月，张辰宇团队等在 BioMaterials 杂志发表论文【9】，通过微泡递送靶向TGFβ1的siRNA,，成功抑制了小鼠肿瘤生长。
尽管在注射、透皮和鼻腔等给药途径取得了显著进步，但对患者来说，口服给药更方便，因此成为首选。但是RNAi疗法的口服给药被胃肠道中的生理屏障所阻碍。
而miRNA的跨界转移的研究进展可能有助于克服RNAi疗法口服给药面临的主要挑战。植物的某些miRNA对胃肠消化过程的抵抗，让植物成为治疗性miRNA的理想载体。
2019年6月，张辰宇团队等在BioMaterials 杂志发表论文【10】，该研究设计并开发了一种基因工程生菜，以生物合成人工miRNA，以生菜的内源性miRNA生物发生机制特异性靶向乙肝病毒表面抗原基因（HBsAg）。口服生菜汤后，人造miRNA被吸收并传递到肝脏中，以抑制转基因小鼠中HBsAg的表达。
治疗15个月后，HBsAg的表达降低，转基因小鼠模型的肝损伤明显减轻，且未观察到毒理作用。
由于工程植物生产干扰序列的有效性、无毒性且经济可行的优势，这种方法也可以拓展到丙型肝炎或其他传染疾病的治疗。可以预测，植物来源的干扰RNA将在RNAi基因治疗中带来一场新的“绿色革命”。
细胞外RNA正在悄悄引发一场生物学革命，而细胞外miRNA在疾病生物标志物、基因治疗、药物递送等领域的突破性进展，也让我们见证了小RNA的大能量。
张辰宇，南京大学教授、博导、南京大学生命科学院院长、南京大学生命科学高等研究院院长，国家杰出青年基金获得者，长江学者。
张辰宇教授领导的3M实验室（MicroRNA、Mitochondrion & Metabolism）近十年来在国际上开拓了许多前沿领域，一直处于国内最顶尖小RNA研究实验室行列。张辰宇教授在 Cell、Nature、Science及其子刊、JCI、PNAS、Cell Research等杂志上发表论文超过200篇，总引42000余次，H指数85。
参看文献：
1、Chen Xi,Ba Yi,Ma Lijia et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.[J] .Cell Res., 2008, 18: 997-1006.
2、Mitchell Patrick S,Parkin Rachael K,Kroh Evan M et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.[J] .PNAS., 2008, 105: 10513-8.
3、Zhang Yujing,Liu Danqing,Chen Xi et al. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration.[J] .Mol. Cell, 2010, 39: 133-44.
4、Chen Xi,Liang Hongwei,Zhang Junfeng et al. Secreted microRNAs: a new form of intercellular communication.[J] .Trends Cell Biol., 2012, 22: 125-32.
5、Yin Yuan,Cai Xing,Chen Xi et al. Tumor-secreted miR-214 induces regulatory T cells: a major link between immune evasion and tumor growth.[J] .Cell Res., 2014, 24: 1164-80.
6、Zhang Lin,Hou Dongxia,Chen Xi et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA.[J] .Cell Res., 2012, 22: 107-26.
7、Zhu Kegan,Liu Minghui,Fu Zheng et al. Plant microRNAs in larval food regulate honeybee caste development.[J] .PLoS Genet., 2017, 13: e1006946.
8、Zhou Zhen,Li Xihan,Liu Jinxiong et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses.[J] .Cell Res., 2015, 25: 39-49.
9、Zhang Yaqin,Li Limin,Yu Jianxiong et al. Microvesicle-mediated delivery of transforming growth factor β1 siRNA for the suppression of tumor growth in mice.[J] .Biomaterials, 2014, 35: 4390-400.
10、Zhang Shuo,Sang Xiaolin,Hou Dongxia et al. Plant-derived RNAi therapeutics: A strategic inhibitor of HBsAg.[J] .Biomaterials, 2019, 210: 83-93.
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