CRISPR/Cas9基因组编辑技术已成为生命科学领域的颠覆性工具，为植物生物学基础研究提供了高效、简便的遗传操作手段，在作物遗传改良和分子设计育种中也具有巨大的应用前景。
植物基因组编辑通常依赖于利用农杆菌或基因枪介导的方式将CRISPR/Cas9等序列特异性核酸酶和选择标记表达框导入受体植物细胞，在选择性培养基中再生获得稳定整合的转基因植株，并进一步鉴定靶基因位点发生了稳定遗传修饰的植株。尽管插入的外源基因随后可通过自交或者回交手段，从编辑后代植株染色体中分离去除，但该过程仍然费时费力，尤其是对于一些倍性复杂、育种周期长或无性繁殖的植物更是如此。
此外，转化过程可造成植物基因组和表观组发生非预期的改变或损伤，且在一些国家基于过程（Process-based）的管理框架下，去除转基因的编辑植物后代仍可能被纳入转基因植物的范畴进行监管，影响该技术在作物育种的应用。因此，发展无需转化的CRISPR/Cas9高效递送方法，建立DNA-free植物基因组编辑技术，有助于加速作物育种进程、降低监管成本、推动基因编辑作物的产业化应用。
病毒载体系统是外源基因体内递送和瞬时表达的理想工具，是转基因稳定表达系统的重要补充。在医学领域，利用腺相关病毒(AAV) 包装和体内递送CRISPR-Cas基因是当前基因治疗最有希望的系统之一，已在多种遗传病治疗的临床试验中表现出良好的效果。在植物学领域，尽管植物病毒表达载体系统也广受关注，但CRISPR/Cas核酸酶基因较大的分子量（包括转录顺式元件可达5-6 kb），远超出了已知的大多数植物病毒载体的包容极限（1-2 kb），目前尚未有利用侵染性植物病毒载体系统递送CRISPR/Cas核酸酶的成功报道。
2020年6月29日，Nature Plants 在线发表了浙江大学李正和教授研究组题为：Highly efficient DNA-free plant genome editing using virally delivered CRISPR-Cas9 的研究论文。
该研究首次报道了利用一种工程化的植物负链RNA弹状病毒载体向植物体内系统递送CRISPR/Cas9核酸内切酶，并高效产生可稳定遗传的靶向基因编辑。Nature Plants同期还配发了题为：Editing through infection的评论文章，对该该研究进行了详细的介绍。
该课题组前期实现了植物负链RNA病毒遗传操作技术的突破，为病毒载体构建提供了可能。在此基础上，研究者将CRISPR/Cas9表达框插入弹状病毒载体，并在gRNA序列两侧连接tRNAGly前体序列，以便利用细胞内源tRNA加工机器对病毒转录的gRNA末端进行精确剪切。重组病毒接种本氏烟可有效形成系统侵染并表达Cas9/gRNA分子，在系统组织中对转基因GFP靶点产生了可高达90%以上靶向编辑。该重组病毒载体可以通过汁液摩擦传代，并维持CRISPR/Cas9稳定表达和高效编辑。电镜观察表明，该弹状病毒通过成比例地扩展病毒粒子的长度来包容病毒基因组中较大外源基因片段的插入，这为其异乎寻常的基因组稳定性和承载能力提供了一种可能的解释。
进一步研究发现，病毒载体递送的CRISPR/Cas9对多个内源基因靶点均表现出较高的编辑频率（40-91%不等）。利用tRNA加工原理，通过对多个gRNA进行串联表达，可以方便实现多靶标编辑和染色体缺失等操作，且编辑效率与单靶标载体相当。
研究者对病毒侵染的叶片组织在无选择的培养基进行培养，对获得的30个M0再生植株进行基因分型（Genotyping）发现，再生植株中93%携带靶向编辑，其中高达57%携带纯和突变或四等位基因突变（烟草为异源四倍体），其中少数植株已脱除了病毒。该研究进一步测定了部分植株的M1和M2后代的基因型和表型，结果表明，产生的基因编辑可在后代中稳定遗传，传递规律符合经典的孟德尔遗传定律。由于弹状病毒无法通过种子传播，所有的M1和M2后代植株均不携带病毒。
RNA病毒复制过程不涉及DNA阶段，病毒基因组无法整合到寄主植株染色体，因而编辑植株不含有外源DNA片段。
总之，该研究提供了一种不依赖于遗传转化、无需分离特定的受体细胞或组织、通过简单易行的病毒侵染方法，可在植株个体水平递送CRISPR/Cas核酸酶进行高效基因组编辑的新方法，为作物DNA-free基因组编辑提供了新的思路。在病毒学领域，研究结果揭示了弹状病毒独特的生物学特性，发展了病毒载体新的应用方向。
浙江大学生物所马晓楠博士研究生为该论文第一作者，李正和教授为通讯作者，研究生张晓艳和刘慧敏也参与部分工作。中国农科院植保所周雪平教授、美国加州大学伯克利分校Andrew Jackson教授和浙江大学舒庆尧教授为研究提供了重要的帮助和建议。该研究得到国家自然科学基金面上项目、浙江省国家自然科学基金重点项目的资助。
https://doi.org/10.1038/s41477-020-0704-5
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