《Nature》子刊：可编程的多阶段药物释放！淋巴内药物运输障碍被攻破！

淋巴结（LN）是在临床治疗中许多疾病的治疗靶标，包括消除B和T细胞恶性肿瘤。LN定位可增强在包括癌症和移植在内的各种治疗环境的功效。然而，由于淋巴管的独特结构和淋巴结网状的大小限制性，很难将货物运送到淋巴结皮质和皮层旁的特定细胞。淋巴管是抗原呈递细胞向局部 淋巴结 引流 （ dLNs ）传递以介导LN皮层内T细胞启动的通道。抗原、细胞因子和/或病原体载货间质液也通过淋巴管输送淋巴液出外周组织至逻辑节点

近日， 佐治亚理工学院生物工程与生物科学研究所 M. G. Finn 和 Susan Napier Thomas教授团队 描述了 结 合聚硫化丙烯 ( PPS ) 的 纳米颗粒 （NP -OND ） 可 克 服 淋巴和淋巴结内运输障碍 的传递系统。 NP -OND 是由纳米颗粒（NP） 中 引入硫醇反应性 7氧杂降冰片二烯 （OND） 接头，在具有可编程可降解接头的外围组织中，它们迅速被输送至引流淋巴结。该平台可控制释放可移动的淋巴内小分子货物，与单独的颗粒或游离化合物相比，其可在整个淋巴结中运输至更多免疫细胞。释放速率可被编程，允许访问不同的淋巴结结构，从而获得特定的淋巴细胞亚群。因此，他们能够改变药物性淋巴结细胞亚型，以提高免疫治疗效果。这项研究成果以题为“Programmable multistage drug delivery to lymph nodes”发表在期刊《 Nature Nanotechnology》。

【图文解析】

1. 体内外多阶段NP-OND时空效应

Pluronic F127胶束内部的PPS活性阴离子乳液聚合（图1a–c）产生稳定的聚合物NP。这些NP由于具有两亲性质，因此非常适合各种分子的缀合，从而为衍生化创建了多个可交换点。最终的Michael加成反应产生的荧光信号可简便的检测该步骤（图1d）。生成的加合物通过retro-Diels–Alder反应（图1a）断裂，其半衰期不同（图1e），且OND取代基不同。

图1 . N P-OND的制备和性质

NP皮内注射后几分钟，组织检查显示预期的淋巴管运输到dLN（图1f）。它不能选择性地靶向dLN，仅当由NP通过OND连锁携带时到达该器官（图1g，h）。对于具有更长半衰期的OND接头， dLN中的丹磺酰（Dn）在72小时内荧光显着增加（图1i）。作为注射的NP-OND共轭物的一部分，游离Dn的量与OND接头的半衰期成反比（图1j）。

2. 增强了向dLN皮质细胞的货运

在LN分区的粒子和溶质是根据大小来规定的（图2a）。这些颗粒被应用于胶原水凝胶，其组成类似于LN的胶原结构，作为LN内扩散的体外模型（图2b）。在37°C下放置12 小时后，与连接到半衰期较长的接头上的若丹明染料（3-Rhod）相比，1-Coum（1-OND）的短片段半衰期可使香豆素染料进一步渗透。NP仅在很小的程度上通过胶原蛋白基质迁移（图2b–d）。在小鼠进行皮内注射后的一天，整个dLN中发现了罗丹明，与保留在外围的NP相比，罗丹明分布得更深，更集中到组织内部（图2e）。尽管被膜下淋巴窦（SCS）出现NP限制，小分子进入LN（副）皮层的能力仍然存在（图2g），小分子仍能通过流式细胞术测量释放的细胞摄取染料。在30–40 ％的LN驻留细胞，Rhod-F（一种小分子染料）从NP大量释放（图2h）。

图 2 . NP-OND对 dLN 驻留细胞群的访问有所改变。

总体而言，通过基于NP的两阶段方法，靶向细胞的数量提高了几个数量级。T细胞从数百种增加到数万种，B细胞从几千到数十万。两种常见细胞（cDCs）从数百到数千（图3a，b）。这些改善LN内的相应细胞亚型的10％，60％和50％（图3c）。除了增加靶向细胞的频率外，从NP释放还导致每个细胞向B细胞以及向浆细胞（pDC）的总货运量增加（图3d）。这些结果可以归因于这些细胞的不对称LN分布，导致输入的淋巴种类可及性有所不同。

图 3 . NP-OND运送到LN驻留单元的货物增加。

3. 设计释放载物的速率

通过对Pluronic电晕的化学修饰，作者设计了基于OND附着来改变载物从PPS NPs释放特性（图4a）。与3-Rhod或4-Rhod结合后，通过透析评估呋喃衍生化分子的释放速率（图4b）。如同带有内部附着货物的颗粒一样，皮内dLN驻留细胞的摄取受接头裂解率控制，在每种情况下，其峰值约为接头断裂半衰期的两倍（图4c）。对于距LN SCS更远的细胞（例如，T细胞与B细胞，图4d），递送程度也随时间增加。

图4：多阶段NP-OND递送的时间效应。

4. 增强免疫治疗剂的生物活性

为了探索使用这种化学方法来增强免疫治疗剂的生物活性，作者还采用了巯基封端的CpG寡核苷酸作为Toll样的受体9（TLR9）配体，这些细胞以及T细胞的总数（图5a）和每种亚型（图5b–d）至少增加了三倍。与仅使用媒介物和仅使用CpG的对照相比，该药物不会引起额外的激活或增殖（图5a–d）。因此，低剂量（0.05 mg kg -1）下的活性都需要NP运输到LN和细胞外淋巴间隙中定时释放。实际上，在同一只动物中，NP-OND-CpG处理的患病LN不大于未患病的nLN（图5e，f），并且通过免疫组织化学观察到LN肿瘤负荷几乎完全消失。这些结果表明该模型中淋巴瘤基本被消除并且被进一步预防。该治疗还减小了原发肿瘤。

图5：使用NP-OND系统的佐剂递送的增强的免疫治疗效果。

【 结论 】

作者在这里展示了由免疫系统处理颗粒抗原的方式所启发的两阶段方法的发展。首先，抗原颗粒被淋巴管有效转移到dLNs，而没有明显的全身性暴露。其次，OND-硫醇化用于将小分子货物附着到这些颗粒上，并以可编程的方式释放，以便在进入淋巴液后被动扩散。有了这个系统，作者实现了对dLN内细胞的总递送量的数量级改善，从而大大增加了对通常难以接近的淋巴细胞亚群的递送。此外，可以通过使用不同片段半衰期的接头来控制该递送的时间。同时，实用的两阶段系统代表了一种前所未有的方式来调整这种生理结构，以便在给药后的所需时间达到目 前难以接近的cDC、T细胞和癌细胞，从而改善治疗效果。在减轻LN肿瘤负担方面已初步证明了这种结果。多阶段递送的概念，无论是具体的还是广泛的，都类似于在针对肿瘤的药物靶向领域中长期探索的策略，但是现今在免疫工程和免疫疗法中并未得到充分利用。