生命的化学——祁海

2019年12月26日，《自然》杂志在线发表了清华大学祁海教授课题组题为《A GPR174-CCL21 module imparts sexual dimorphism to humoral immunity》(“GPR174-CCL21受配体模组引起体液免疫应答的性别二态性”)的研究论文。该研究发现了一种导致两性之间抗体免疫应答差异的新机制，为增强疫苗接种效果以及针对抗体介导自身免疫疾病的治疗提供了新思路和潜在新靶点。

GPR174-CCL21调控体液免疫应答的两性差异

作者：赵若竹，祁 海(清华大学医学院)

摘要：

体液免疫应答具有明显的两性差异。通常女性产生的针对外来病原体或者自身抗原的抗体水平相比男性更高，因此女性比男性更容易清除病原体的感染，但女性也比男性更容易患自身免疫疾病。长效且高亲和力的体液免疫应答依赖由B细胞形成的生发中心(germinalcenter, GC)反应，然而B细胞形成GC的能力是否存在两性差异从而直接导致体液免疫应答的两性差异尚不清楚。

本研究提出了一套在分子和细胞水平上解释体液免疫应答两性差异的新机制，即雄激素可以增强B细胞表达的GPR174在接收到CCL21信号后与Gαi蛋白的结合水平，由此促进雄性B细胞更多地迁移在滤泡外周，而不能更多地迁移至滤泡中心形成GC及抗体应答，从而直接介导体液免疫应答的两性差异。本文为解决在增强保护性疫苗抗体应答水平以及治疗自身免疫疾病时遇到的B细胞介导的两性差异问题提供了新的见解。

关键词：GPR174；体液免疫应答；B细胞迁移；生发中心；雄激素

1、免疫相关疾病易感性与疫苗应答的两性差异

男性和女性的免疫相关疾病易感性以及疫苗应答存在显著的差异，而其中一部分原因来自于性别的影响。性别会同时影响免疫系统对自身抗原(例如隐蔽抗原、改变修饰的自身抗原和交叉抗原)和外来抗原(例如来自真菌、病毒、细菌、寄生虫和过敏原的抗原)的反应。一般来说，成年女性比男性拥有更强的先天和获得性免疫反应。这使得女性比男性能更快地清除病原体以及产生更强的疫苗效力，但同时也增加了她们对自身免疫疾病的易感性。

自身免疫疾病是一类由于免疫系统攻击自身体内正常细胞(甚至是细胞内的各种正常组成部分)产生的不正常的过度炎症反应或者组织伤害而最终影响机体健康的疾病。它主要包括81种慢性疾病，在世界范围内人群的总发病率约为5%，在男性群体中的发病率约为3%，而在女性群体中的发病率约为7.1%[1]。最新一项美国2010-2016年22种常见自身免疫疾病的临床性别分布汇编统计显示：最显著的女性/男性发病率比是干燥综合征(约9.5:1)、系统性红斑狼疮(约7:1)、硬皮症(约5:1)和原发性胆汁性肝硬化(约4.5:1)；其次是类风湿性关节炎(约2.5:1)、多发性硬化症(约2.5:1)、乳糜泻(约2:1)、自身免疫性甲状旁腺功能减退(约2:1)和多肌炎/皮肌炎(约2:1)这些疾病；较弱的女性偏向的是斑秃(约1.5:1)、自身免疫性中性粒细胞减少(约1.5:1)、爱迪生氏病(约1.5:1)和免疫性血小板减少性紫癜(约1.5:1)。在这22种常见的自身免疫疾病中，有3种不仅发病率高而且女性偏向明显：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化症[2]。

传染性疾病的感染是由一些特异的病原体(包括病毒、细菌、真菌或者寄生虫等)入侵机体并且突破机体的防御功能后通过生长与繁殖引起机体生理和病理相关的变化。据统计，传染性疾病的易感性和死亡率也有明显的两性差异[3]。根据粗略的发病率数据显示：青春期后的男性明显地更容易感染细螺旋体病、皮肤利什曼病和瘤型麻风(男性：女性发病率比值>2)；在内脏利什曼病、血吸虫病、肺结核、流行性脑脊髓膜炎和甲型肝炎上的发病率也有细微差异(男性：女性发病率比值>1)；而结核样型麻风、伤寒症和重症登革热的发病率没有明确的性别差异(男性：女性发病率比值≈1)。

通常儿童或成年人在接种卡介苗、麻疹、腮腺炎和风疹疫苗和流感疫苗等后，女性所产生的保护性抗体反应高于同等年龄段男性[4, 5]。全球引发季节性流感的流感病毒以四种类型为主：A型H1系和H3系以及B型Victoria系和Yamagata系。通常三价流感疫苗组份为：H1系类似株、H3系类似株以及Victoria系类似株。一项由美国开展的18~49岁人群以及50~64岁人群接种三价流感疫苗后血清中针对H1N1、H3N2以及B型Victoria系类似株的特异性抗体的结果显示：在接受全剂量疫苗接种后，18~49岁女性分别针对H1N1、H3N2以及B型Victoria系类似株的抗体效价为同龄男性相应抗体效价的1.3倍、1.6倍以及1.5倍，50~64岁女性分别针对H1N1、H3N2以及B型Victoria系类似株的抗体效价为同龄男性相应抗体效价的1.5倍；在接受半剂量疫苗接种后，18~49岁女性分别针对H1N1、H3N2以及B型Victoria系类似株的抗体效价为同龄男性相应抗体效价的1.3倍、1.7倍以及1.3倍，50~64岁女性分别针对H1N1、H3N2以及B型Victoria系类似株的抗体效价为同龄男性相应抗体效价的1.3倍、1.3倍以及1.1倍[6]。这也说明，接种半剂量流感疫苗的女性与接种全剂量流感疫苗的男性可以获得相同的抗体效价。

综上所述，自身免疫疾病易感性、传染病易感性以及保护性疫苗抗体应答均存在明显的两性差异。

2、体液免疫反应的两性差异

自身免疫疾病由自身抗体引发导致组织器官损伤。传染病的病原体疾病由机体产生的针对外来病原体的特异性抗体清除。保护型疫苗的效力主要依赖于机体产生的针对疫苗主要成分的特异性抗体。机体产生抗体依赖于体液免疫反应，因此自身免疫性疾病易感性、传染性疾病易感性以及疫苗应答的两性差异暗示体液免疫反应也存在明显的两性差异。

生发中心(germinalcenter, GC)是在次级淋巴器官中B细胞对T细胞依赖的抗原反应而形成的一种短暂结构。淋巴结结构以滤泡区和T细胞区为主要特征：滤泡区主要由IgM+IgD+初始B细胞组成，并由滤泡间区分隔；T细胞区主要由CD3+CD4+和CD3+CD8+初始T细胞组成，与这些滤泡区相接。生发中心形成于这些滤泡区域的中心，其中包含一个滤泡树突状细胞(follicular dendritic cell, FDC)网络。

当接受抗原刺激后，抗原特异的B细胞和T细胞在滤泡和T细胞边缘区域增殖并相互作用[7]。这时一部分T细胞便开始上调B细胞淋巴瘤-6(B-cell lymphoma 6, BCL-6)的表达，在第2天大部分T细胞已获得Tfh细胞表型[表达趋化因子受体CXCR5(C-X-C motif chemokine receptor 5)、程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD1)和激活标记(GL-7)[8]。.到第3天，这些早期的Tfh细胞从滤泡外迁移到滤泡区域来辅助B细胞形成生发中心[9-10]。在与T细胞互作后，一部分B细胞分化为短寿命的浆细胞，分泌对入侵的病原体亲和力较低的抗体[11]；倾向于进入GC通路的B细胞在第2天才开始上调BCL-6的表达[12-13]，在第四天开始有GC前体B细胞迁移到滤泡中心形成早期GC。这些结果总体上表明，抗原特异性B细胞和T细胞完成早期分化并快速参与到GC反应中主要是通过上调BCL-6的表达来实现的。

早期GC建立后会在滤泡中心区域形成一个微环境，此时B细胞生长并分化为B细胞母细胞。B细胞母细胞会迅速分裂并开始填充滤泡中心的FDC网络[14]。在第5~6天的时候，由于B细胞的快速增殖，GC的大小也在快速增长。持续到第7天的时候，GC已经完全建立，并且分化成两个微环境：暗区和亮区。暗区以其组织学外观命名，由密集排列的细胞组成；这些细胞在表达CXCL12(C-X-C motif chemokine ligand 12)的网状细胞网络中增殖，其在形态学上类似于亮区的FDC。亮区要比暗区细胞的分布稀疏很多；其特征是存在多种细胞类型，包括GC B细胞、Tfh细胞、FDC和巨噬细胞。

GC的暗区和亮区由趋化因子受体CXCR4不同的表达量来组织[15]。暗区B细胞可被识别为CXCR4hiCD83lowCD86low细胞，亮区B细胞可被识别为CXCR4lowCD83hiCD86hi细胞。GC B细胞在暗区快速增殖，并通过体细胞高频突变(somatic hypermutation, SHM)进一步使重组的IgV基因多样化；进入亮区后，表达高亲和力抗原受体的GC B细胞可以被Tfh细胞筛选出来。两个区域之间的循环促进了几轮迭代的突变和选择，因此GC暗区和亮区的极化对GC的优化性能至关重要。SHM的空间分离和对高亲和力GC B细胞的选择是有效的一轮亲和力成熟所必需的。如果没有这种极化，可能会发生不合适或过早的选择。

Tfh细胞在筛选携带针对抗原的高亲和力受体的B细胞的过程中起主导作用。GC B细胞通过BCR(B cell receptor)捕获抗原，并将处理后的抗原通过MHC(major histocompatibility complex)Ⅱ复合物呈递给Tfh细胞。较高的BCR亲和力与较高的抗原捕获度直接相关，使得B细胞表面可以拥有较高的MHCⅡ-抗原肽密度从而获得T细胞的最大份额的帮助来驱动筛选。活体双光子成像显示，Tfh细胞与GC B细胞的接触是十分短暂的，因此Tfh细胞可以连续检测亮区中许多不同的B细胞：当Tfh细胞和某一个B细胞可以通过MHCⅡ-抗原肽-TCR(T cell receptor)复合物形成最大、最长的接触时，Tfh细胞便可以在群体水平上筛选出携带亲和力最高受体的GC B细胞[16]。

3、GPCR在生发中心反应中的功能

研究表明，B细胞和T细胞在次级淋巴器官中的分布和动态迁移以致最后定位到滤泡区域中心起始生发中心反应受到G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCR)家族分子的严格调控[17]。

在激活前，初始的B细胞和T细胞在脾脏和淋巴结内被分隔成不同的区域，其特征是B细胞滤泡围绕着中心的T细胞区排列[18]。这两个区域也包含不同的基质细胞网状网络。在B细胞滤泡中，FDCs表达CXCL13，吸引CXCR5表达的B细胞。T区成纤维细胞网状细胞(broblastic reticular cells, FRCs)表达CCL19(C-C motif chemokine ligand 19)和CCL21(C-C motif chemokine ligand 21)，促进表达CCR7(C-C motif chemokine receptor 7)的T细胞迁移[19]。

B细胞在滤泡中的随机迁移促进了与其同源抗原的接触[20]。根据抗原的大小、形式及其进入人体的途径，抗原可以多种不同的方式被呈递给B细胞。小的可溶性抗原可经淋巴液从皮肤组织中排出，再经淋巴管进入淋巴结，最后经被膜下窦(subcapsular sinus, SCS)进入髓窦；另一些小抗原可以通过从SCS延伸至高内皮小静脉(high endothelial venules, HEVs)的导管扩散进入滤泡；SCS的巨噬细胞也可以通过其表面的受体捕获抗原并传递给B细胞。对于大颗粒抗原来说， DC细胞或其他髓样细胞可以将它们捕获并且迁移到淋巴结后传递给B细胞；B细胞可以通过表面的补体受体(complement receptor, CR)或FcγRIIb(Fc gamma receptor)携带抗原复合物并传递给滤泡中心的FDC，在这之后FDC可以在长时间内将这些抗原呈递在其表面以供同源B细胞识别。

当遇到同源抗原并通过BCR激活后，B细胞会上调CCR7。CCR7将B细胞导向T区边界[21]增加与同源T细胞的相互作用。抗原特异的B细胞和T细胞在B-T边界处稳定接触后共同上调EBI2向滤泡间和滤泡外区域迁移[22, 23]。EBI2(Epstein–Barr virus-induced gene 2, also known as GPR183)是7a,25-羟胆甾醇(7α,25-Dihydroxycholesterol, 7a,25-OHC)的受体，主要由滤泡外周的基质细胞表达[24-25]。

如前所述，在T细胞依赖的抗体反应过程中，抗原激活的B细胞和T细胞在淋巴环境中经过一系列协调运动后，最终在滤泡中心形成生发中心。然而，目前引导GC 前体B细胞到滤泡中心的机制尚不完全清楚。现有的研究表明，EBI2的下调发生在GC B细胞中，并且对GC定位滤泡中心具有重要意义[26]。CXCR5也是GC定位和组织的另一个重要决定因素。CXCR5缺陷小鼠的B细胞可形成GCs，但体积比正常小鼠小，脾脏GCs形成于动脉周围淋巴鞘(periarteral lymphatic sheath, PALS)而非滤泡区域，这说明CXCR5对GC前体B细胞的正确定位具有重要作用[27]。同时，FDC高表达CXCL13，因此也会促进GC前体B细胞到滤泡中心的定位[28]。另外一项研究发现，GC B细胞上调并表达高水平的鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2, S1PR2)，这是鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)受体家族中的一员。这个家族一共包括5个成员(S1PR1~S1PR5)。S1PR2在GC B细胞定位中起重要作用，S1PR2促进B细胞向滤泡中心移动并将其限制在GC中[26]。

综上所述，GC反应的细胞动力学是建立长期高亲和力体液免疫应答的重要基础。在此之前从未有关于性别差异的生发中心反应的研究被报道。因此阐明这些具体过程的分子调控机制可以帮助我们更好地理解生发中心反应，并且进一步明确体液免疫应答的两性差异。

4、GPR174-CCL21调控体液免疫应答的两性差异

清华大学祁海课题组的研究[29]首先构建了一个模式抗原免疫系统：HEL-OVA(hen egg lysozyme-ovalbumin)抗原刺激在体内可以分别激活针对HEL特异的MD4 B细胞和针对OVA 323-339特异的OT-II CD4+ T细胞，同时MD4 B细胞和OT-II T细胞因为HEL-OVA交联抗原可以形成共轭作用，在此之下OT-II T细胞辅助MD4 B细胞形成生发中心。利用这个系统，我们将性别差异限定在MD4 B细胞上，而OT-II T细胞以及小鼠我们均采用雄性。我们首先发现，MD4 B细胞形成生发中心有明显的两性差异，而这一过程依赖于MD4 B细胞两性差异地定位到滤泡中心即生发中心形成之处：雌性GC前体B细胞比雄性GC前体B细胞可以更多地迁移回到滤泡中心，从而形成更多的生发中心B细胞。

GC的形成依赖于GPCR家族分子协同调控B细胞的动态定位。因此这说明存在一些GPCR调控GC前体B细胞滤泡中心定位的两性差异。鉴于早期研究鉴定出的对GC前体B细胞向滤泡中心定位的GPCR分子包括S1PR2、EBI2和CXCR5并未有两性差异作用方式的报道，我们推测有其他未知的GPCR分子可以以两性差异的方式调控GC前体B细胞向滤泡中心区域定位。

B细胞的动态定位指的是在不同活化或者分化阶段，差异表达的GPCR可以使其定位到特殊的微环境获取足够的命运决定信号，才能最后有效地分化成GC B细胞。S1PR2在初始B细胞上低表达，在GC前体 B细胞上高表达，而S1PR2的趋化配体S1P在滤泡区域的表达是从外周向中心递减，并且S1P与S1PR2的配体-受体作用是负调控B细胞迁移[26, 30]，因此高表达S1PR2的B细胞可以更多地向滤泡中心区域定位。而EBI2则相反，其在初始B细胞上高表达，在GC 前体B细胞上低表达，EBI2的趋化配体7a,25-OHC在滤泡区域的表达是从外周向中心递减，并且7a,25-OHC与EBI2的配体-受体作用是正调控B细胞迁移[25]，从而使得GC前体B细胞更好地向滤泡中心区域定位。

该研究鉴定出GPR174在B细胞不同的活化或者分化阶段有差异表达：在初始B细胞上高表达，在GC B细胞上低表达。同时我们鉴定出来GPR174的趋化配体是CCL21。已知的研究表明，CCL21在滤泡区域的表达是也是从外周向中心递减，并且CCL21与GPR174的配体-受体作用是正调控B细胞迁移，所以当GC前体B细胞下调GPR174便能更好地向滤泡中心区域定位。

重要的是，我们发现GPR174在调控GC前体B细胞向滤泡中心区域定位的过程中存在两性差异：GPR174抑制雄性GC前体B细胞迁移回滤泡中心，但不影响雌性GC前体B细胞。因此我们可以认为，雄性B细胞上的GPR174降低了雄性GC前体B细胞滤泡中心区域定位的能力而不是雌性B细胞上的GPR174提高了雌性GC前体B细胞滤泡中心区域定位的能力。

同样地，我们发现B细胞上的GPR174在调控生发中心反应、抗体应答以及自身免疫疾病易感性时也存在两性差异：GPR174抑制雄鼠生发中心B细胞形成、浆细胞形成与抗体分泌、自身免疫严重程度，但不影响雌鼠。因此我们可以认为，这些是由于雄性B细胞上的GPR174降低了雄性GC前体B细胞滤泡中心区域定位的能力。早期研究表明，性激素和性染色体可以导致免疫反应的两性差异[31]。性染色体可以介导免疫反应的两性差异。在具有相同性腺但是不同性染色体的转基因小鼠身上(这样可以排除性激素的差异)，携带XX性染色体的小鼠要比携带XY性染色体的小鼠更容易患自身免疫疾病，同时生成更多的自身抗体以及相关的细胞因子[32]。这些现象可能是由于一些位于X染色体或者Y染色体的免疫相关基因有差异表达，从而导致两性差异的体液免疫应答[33]。

性激素也可以介导免疫反应的两性差异。不管是对于T细胞依赖还是非依赖的抗原，去势的雄鼠都比正常雄鼠的抗体应答水平高[34]；同时雄激素的处理可以抑制B细胞的增殖以及分泌抗体的水平[35, 36]。这些现象说明，雄激素对于体液免疫应答主要是抑制作用。同样地，正常雌鼠对于一些疫苗的体液免疫应答比去势雌鼠强[37, 38]；雌激素处理可以提高B细胞的活化与抗体产生[39-41]。这些现象说明，雌激素对于体液免疫应答主要是促进作用。

由于GPR174位于X染色体上，假如GPR174可以逃脱X染色体失活导致的剂量补偿，那么在B细胞上表达的两性差异便可以直接解释GPR174两性差异的作用。但是我们对雄性和雌性B细胞GPR174的mRNA水平进行检测后，并未发现其存在任何明显的转录水平的两性差异。这说明GPR174的两性差异作用与性染色体无关。

因此，我们分析了性激素对于GPR174两性差异作用的必要性。通过性激素剥夺和性激素回补实验，我们发现雄激素是调控GPR174两性差异地介导GC前体B细胞向CCL21迁移的必要且充分的因素。具体地，雄激素可以使得雄性B细胞上的GPR174比雌性B细胞上的GPR174在接受CCL21刺激后结合更多的促迁移蛋白Gαi，从而更好地促进B细胞对CCL21的迁移。因此雄激素可以通过降低雄性GC前体B细胞的滤泡中心区域定位来抑制雄性的生发中心反应和抗体应答，造成体液免疫应答的两性差异。

该研究提出了一套在分子和细胞水平上解释体液免疫应答两性差异的新机制，即雄激素可以增强B细胞上的GPR174在接收到CCL21信号后与Gαi蛋白的结合水平，由此促进雄性B细胞更多地迁移在滤泡外周，而不能更多地迁移至滤泡中心形成GC及抗体应答，从而直接介导体液免疫应答的两性差异。

人物简介：祁海教授，教育部长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者，“973”计划项目首席科学家，万人计划“中青年科技创新领军人才”。他曾获美国免疫学家协会研究者奖(2018)、树兰医学青年奖(2018)、吴阶平-保罗杨森医学药学奖(2016年)，华人生物学家协会青年奖(2016年)和谈家桢生命科学奖创新奖(2015年)。近年来，祁海教授研究组在体液免疫调节领域，特别是滤泡辅助T细胞发育与生发中心反应调控等方向取得多项原创性成果，包括揭示共刺激分子控制滤泡辅助性T细胞迁移与发育的新机制，发现生发中心B细胞亲和力筛选的细胞间正反馈原则，发现神经导向分子构建生发中心动态微环境的新功能，定义生发中心记忆前体B细胞并描绘其产生过程等。

说明：原文发表在《生命的化学》杂志，经授权BioArt全文转载！

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