具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能乳酸杆菌的筛选

大多数针对癌症的化疗药物通过诱导细胞凋亡发挥其作用。但这些化疗药物有不容忽视的副作用，例如化疗引起的黏膜炎和放疗引起的腹泻，这些药物损害了肠黏膜并改变了吸水能力。大量研究集中在结肠癌的机制上，结肠癌的有效预防和治疗已成为医学研究的焦点。乳酸菌抗癌作用的潜在机制可能为改变宿主肠道微生物群的种类或数量、提高宿主的免疫应激、抑制肿瘤生长、控制潜在有害细菌生长、产生抗肿瘤或抗诱变的代谢物等。乳酸菌的活菌体具有激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的功能，诱导结肠癌细胞凋亡并且可抑制Caco-2细胞以及HT-29细胞增殖。

生物氧化是生命有机体的重要生理过程，为生命提供能量的同时产生活性氧。研究表明一些疾病如癌症、动脉粥样硬化及心血管疾病等都与体内活性氧的产生有关，但抗氧化防御系统不能完全有效地抵御或修复氧化带来的损伤。氧化DNA损伤诱导是某些药物诱发癌症癌变的初步反应，而乳酸菌可以有效地减少氧化DNA损伤所造成的癌症。

东北农业大学乳品科学教育部重点实验室的岳莹雪、闫芬芬和霍贵成*等人以传统发酵乳制品中分离出的15 株乳酸杆菌为研究对象，以具有良好黏附性能和益生功能的商业菌株LGG作为对照，对乳酸杆菌抑制HT-29细胞增殖、黏附性及其抗氧化性进行研究。筛选出高抑制率乳酸杆菌，再通过主成分分析的方法筛选出高黏附性以及良好抗氧化性的乳酸杆菌，并对筛选出的菌株进行模拟胃肠道耐受性评价，以期为乳酸菌功能食品的开发提供参考。

1、抑制HT-29细胞乳酸杆菌的筛选

16 株菌对HT-29细胞均表现出一定的抑制效果，且对HT-29细胞的抑制作用差别显著（2.78%～15.63%，P＜0.05），结果显示，其中嗜酸乳杆菌KLDS1.1003、KLDS1.0901、KLDS1.0902和植物乳杆菌KLDS1.0386、KLDS1.0318、KLDS1.0344、KLDS1.0317、1-2的抑制活性均高于参考菌株LGG，分别为15.63%、15.00%、12.70%、12.52%、11.90%、11.81%、11.57%和10.02%，并显著高于其他菌株。鼠李糖乳杆菌KLDS1.0205和5，植物乳杆菌1-5、2-2、4-4、4-5和8-6的抑制率均低于参考菌株LGG。因此，筛选8 株高于参考菌株的乳酸杆菌进行黏附HT-29细胞以及抗氧化功能的实验。

2、乳酸杆菌对HT-29细胞的黏附能力

乳酸杆菌与HT-29细胞作用后黏附能力结果显示，9 株乳酸杆菌活菌体对HT-29细胞的黏附率差别显著（3.9%～19.1%，P＜0.05）。参照菌株LGG对HT-29细胞的黏附率为6.1%。其中黏附率依次为嗜酸乳杆菌KLDS1.0901＞植物乳杆菌KLDS1.0318＞植物乳杆菌KLDS1.0386＞植物乳杆菌KLDS1.0344，明显高于其他菌株并高于参照菌株LGG，分别为19.10%、17.00%、13.80%和10.39%。其他菌株黏附率较低均不足6%。本实验中，嗜酸乳杆菌KLDS1.0901与植物乳杆菌KLDS1.0318的黏附率较高且高于参照菌株。同时，9 株乳酸杆菌对细胞的黏附能力存在菌种差异性的同时也存在菌株差异性。

3、乳酸杆菌抗氧化能力

3.1 还原性

乳酸杆菌的还原能力以半胱氨酸还原标准曲线计算，结果表明9 株乳酸杆菌均具有一定还原能力，范围为23.43～271.76 μmol/L的L-半胱氨酸盐酸盐量，且每种样品均具有显著差异（P＜0.05）。其中活菌悬液还原能力最高的为嗜酸乳杆菌KLDS1.0901（170.84 μmol/L），其次为嗜酸乳杆菌KLDS1.1003（161.11 μmol/L），其他菌株均在50 μmol/L以上。嗜酸乳杆菌KLDS1.1003与嗜酸乳杆菌KLDS1.0902菌体细胞破碎液的还原能力较强分别为193.51、175.69 μmol/L。其他菌株均在20μmol/L以上。在菌体发酵上清液的还原能力中较强的为LGG（271.76 μmol/L）与嗜酸乳杆菌KLDS1.0901（246.16 μmol/L），其他菌株均在70 μmol/L以上。由实验结果推断，不同属及同属不同的菌株具有还原能力的活性物质含量不同。还原能力一般为菌体发酵上清液＞活菌悬液＞菌体细胞破碎液，其中LGG菌体发酵上清液还原能力最佳。

3.2 DPPH自由基清除能力

结果显示，9 株乳酸杆菌清除DPPH自由基范围为10.89%～50.42%。活菌悬液清除能力最强的为嗜酸乳杆菌KLDS1.1003（44.35%）且与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在19%以上。同时嗜酸乳杆菌KLDS1.0901细胞破碎液清除率较强为27.34%，与植物乳杆菌KLDS1.0344和LGG无显著差异（P＞0.05），与其他6 菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。在菌体发酵上清液中清除能力较强的为鼠李糖乳杆菌LGG（50.42%），与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在27%以上。乳酸杆菌清除DPPH自由基能力多数为菌体发酵上清液大于活菌悬液，而菌体细胞破碎液的清除能力最差。本实验结果嗜酸乳杆菌KLDS1.1003活菌悬液DPPH自由基清除率为44.10%。

3.3 羟自由基清除能力

结果显示，9 株乳酸杆菌清除羟自由基范围为7.46%～33.16%。活菌悬液清除能力较强的为植物乳杆菌KLDS1.0317（33.16%）、植物乳杆菌1-2（28.45%），与其他菌株具有显著差异（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。植物乳杆菌KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、KLDS1.0317和LGG的菌体细胞破碎液清除率与其他菌株差异显著（P＜0.05），最高的为植物乳杆菌KLDS1.0318（26.77%），其他菌株均在17%以上。在菌体发酵上清液中清除能力最强的为植物乳杆菌KLDS1.0318（10.65%），与部分菌株具有显著差异（P＜0.05），其他菌株均在8%以上。乳酸杆菌活菌悬液清除羟自由基能力多数大于菌体细胞破碎液，最低的为菌体发酵上清液，说明这几株菌的羟自由基清除活性成分主要存在于其胞内成分和完整菌体中。与本实验3 种供试样品清除能力一致。

3.4 超氧阴离子自由基清除能力

结果显示，9 株乳酸杆菌超氧阴离子自由基清除率范围为17.64%～46.13%。活菌悬液清除能力较强的为LGG（46.13%）、植物乳杆菌KLDS1.0344（33.61%），两者差异显著（P＜0.05），其他菌株均在17%以上。嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的菌体细胞破碎液清除率较强为42.32%，且与其他菌株差异显著（P＜0.05）。其他菌株均在33%以上。在菌体发酵上清液中清除能力较强的为植物乳杆菌KLDS1.0318（26.53%）与植物乳杆菌KLDS1.0344（26.19%），这两株不具有显著差异（P＞0.05），但与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在16%以上。

本实验乳酸杆菌超氧阴离子自由基清除能力整体上为菌体细胞破碎液＞活菌悬液＞菌体发酵上清液，说明几株菌清除超氧阴离子自由基的活性物质大部分存在于胞内。本实验植物乳杆菌KLDS1.0344活菌悬液清除率为33.61%，相比较高于菌株La5。

3.5 乳酸杆菌脂质抗氧化能力

结果显示，9 株乳酸杆菌脂质抗氧化能力范围为10.45%～51.91%。活菌悬液清除能力较强的为植物乳杆菌KLDS1.0901（50.98%）和植物乳杆菌1-2（45.42%），其他菌株均在21%以上且每株菌之间都具有显著差异（P＜0.05）。植物乳杆菌KLDS1.0318与LGG的菌体细胞破碎液清除率较强，分别为51.96%和47.71%，且与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。

在菌体发酵上清液中清除能力较强的为植物乳杆菌1-2（32.97%)与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在22%以上。9 株乳酸杆菌脂质抗氧化能力在活菌悬液与菌体细胞破碎液中因菌株不同而强弱不同，但菌体发酵上清液为三者中最低，推断3 种物质脂质抗氧化能力因菌株而异。而乳酸杆菌抗氧化性能可能是因其不同且相对独立的抗氧化机制所致。

4、主成分分析

图7A为各个特性在各主成分中占的载荷分布图。成分1和2共占总变量的53.48%，第1主成分解释为活菌悬液还原性、活菌悬液DPPH自由基清除能力、破碎液DPPH自由基清除能力、上清液DPPH自由基清除能力、活菌悬液羟自由基清除能力、上清液超氧阴离子自由基清除能力、活菌悬液脂质抗氧化能力及上清液脂质抗氧化能力；第2主成分解释为破碎液还原性、上清液还原性、上清液DPPH自由基清除能力、破碎液羟自由基清除能力、活菌悬液超氧阴离子自由基清除能力、破碎液脂质抗氧化能力和黏附性。

图7B展示了所选益生菌的分布，根据图7B和表2可以看出，嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的综合得分最高为2.48，高于对照菌株，其次为嗜酸乳杆菌KLDS1.1003得分为0.88，明显高于其他菌株，嗜酸乳杆菌KLDS1.0902的综合得分最低。该结果表明嗜酸乳杆菌 KLDS1.0901及嗜酸乳杆菌KLDS1.1003是8 株中具有良好黏附性以及抗氧化特性的益生菌。

5、乳酸杆菌胃肠液耐受性

最后筛选出2 株益生功能较好的菌株，对其在模拟胃肠液中的耐受性进行实验。本实验选取胃液pH 3.0。肠液pH值通常为7.6左右，本实验选取pH 7.0。2 株乳酸杆菌在模拟胃肠液中的耐受性结果显示，嗜酸乳杆菌KLDS1.0901与KLDS1.1003在pH 3.0的模拟胃液中3 h后活菌数虽略有下降，但均可达108 CFU/mL以上。经过模拟胃液耐受后再经过pH7.0的模拟肠液3 h后活菌数同样有一定程度下降，但仍然可达108 CFU/mL以上。本实验2 株乳酸杆菌经过模拟胃液3 h再经过模拟肠液3 h后菌体浓度都保持在108 CFU/mL，其成活率也可达50%，可发挥益生作用，因此具有较好的胃肠液耐受性。

结 论

本实验以15 株实验室保藏菌株为研究对象，以乳酸杆菌对HT-29细胞增殖的抑制、黏附以及抗氧化作用为筛选指标，筛选出对结肠癌细胞具有抑制效果的益生菌。初筛8 株对HT-29细胞具有抑制效果的乳酸杆菌。随后的乳酸杆菌抗氧化实验结果显示，乳酸杆菌活菌悬液、菌体细胞破碎液及菌体发酵上清液均具有一定抗氧化性，但不同抗氧化实验三者效果不同，并且不同菌株对HT-29细胞的黏附率也有所不同。主成分分析对黏附性以及抗氧化性进行综合评估，结果表明嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的得分最高，嗜酸乳杆菌KLDS1.1003次之，且2 株菌具有良好的耐受性和抑制人体结肠腺癌细胞系HT-29细胞能力。

本文《具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能乳酸杆菌的筛选》来源于《食品科学》2020年41卷8期77-82页，作者：夏伟荣，李莹，柴智，陈小娥，周剑忠，冯进，方旭波。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181209-106。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在成功召开“2019年动物源食品科学与人类健康国际研讨会（宁波）”的基础上，将与青海大学农牧学院于2020年6月20-21日在西宁共同举办“2020年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。研讨会将就肉、水产、禽蛋、乳制品等动物源食品科学基础研究、现代化加工技术，贮藏、保鲜及运输，质量安全与检测技术，营养及风味成分分析，副产物综合利用，法律、法规及发展政策等方面的重大理论研究展开深入探讨，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。

在此，我们诚挚的邀请您出席本次国际研讨会，共聚人脉、共享资源、共谋发展！

修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅