小麦主要过敏原CM16线性B细胞表位的预测及初步鉴定

小麦致敏机制比较复杂，不同种类的小麦蛋白都有可能引起过敏反应，有不同的致敏性及发病机制，并呈现不同的临床症状。 CM16属于醇溶蛋白超家族中的大型谷物胰蛋白酶或α-淀粉酶抑制剂家族。 该家族蛋白质广泛存在于谷类、豆类以及其他较高等植物中，对胰淀粉酶具有较强的抑制作用。

B细胞表位是抗原中可被B细胞抗原受体或抗体特异性识别并结合的线性片段或空间构象性结构，其刺激机体产生B细胞介导的体液免疫应答，并产生效应分子（抗体）和效应细胞。B细胞表位预测是表位预测的一个重要组成部分。通过生物信息学软件分析抗原表位是目前常用的表位研究方法之一。但该方法主要基于蛋白质的一级氨基酸序列，忽略了氨基酸之间的分子作用力，具有一定的局限性，需要结合抗消化实验以及质谱分析加以验证。

因此，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心以及中国农业大学食品科学与营养工程学院的李雪娇、李欣芮和车会莲*等人拟利用生物信息学法预测CM16线性B细胞表位，与质谱得到的抗消化肽段信息进行比对，以期证明抗消化性结合生物信息学分析鉴定过敏原线性B细胞表位的方法的可行性和应用性。

1. 小麦粗蛋白提取物主要成分分析

小麦蛋白粗提物电泳结果显示，小麦总蛋白具有5 条明显的电泳条带，其中分子质量在17 kDa的蛋白质含量最高，经灰度值分析，约占总蛋白含量的40%，其分子质量对应小麦过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16。由图1可知，小麦蛋白粗提物主要是由17 kDa处的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16和大于180 kDa的高分子质量谷蛋白低聚物组成，这两种蛋白质具有热稳定性，经37 ℃温育60 min后，含量未发生明显变化。在胃蛋白酶作用下，消化第30秒时，高分子质量谷蛋白低聚物迅速被降解，产生分子质量低于10 kDa的片段，而17 kDa处的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16在第30秒时保持完整，第5分钟时才被完全降解。随着消化进行，低于10 kDa的抗消化片段直至消化结束时仍可被检测。

结果表明，高分子质量谷蛋白低聚物极易被胃蛋白酶消化，α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16易被消化，但小麦过敏原在消化过程中会产生消化抗性片段，具有潜在致敏活性。因此后续选取α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16进行线性B细胞表位与抗消化肽段之间关系的研究。

2. 小麦过敏原CM16可能线性B细胞表位的预测结果

如图2所示，在氨基酸亲水性分析中，亲水性指数大于0表明亲水性好，CM16的亲水性区域分布较为均匀，其中亲水性较高的区域分别为AA 88～100和AA 137～143。在可塑性分析中，发现AA 26～32、AA 39～51、AA 54～62、AA 64～67、AA 75～78、AA 89～98、AA 103～108、AA 130～132和AA 138～140区域具有一定的柔性，容易发生折叠、弯曲，易与抗体结合。在抗原指数分析中，以抗原指数大于0为筛选条件，结果显示抗原指数较高的区域为AA 26～34、AA 42～63、AA 66～70、AA 71～84、AA 88～99、AA 100～111和AA 137～143，可能含有潜在的优势抗原表位。最后对于CM16的表面可及性进行了分析，表面可及性指数大于1为筛选条件，结果显示AA 47～50、AA 58～60、AA 62～65、AA 90～96和AA 138～143区域具有较好的表面可及性。综合以上各参数，将同时满足4 个参数筛选条件的表位预测为CM16可能的线性B细胞表位。

3. 过敏原CM16线性B细胞表位的二级结构预测结果

图3 为使用DNAStar软件中的Chou-Fasman和Garnier-Robson方案对CM16二级结构进行预测的结果。分析可知，两种方案在预测CM16的转角区域时具有一定的相似性，但对于α-螺旋和β-折叠的预测具有基本相反的结果，还需要结合三级结构进行分析。总体来看，CM16蛋白质二级结构中有序的螺旋、转角结构占据了主要优势，反映了蛋白质具有良好的紧密结构。

4. 过敏原CM16预测线性B细胞表位的空间定位

通过了解氨基酸残基的Φ和Ψ角信息，获得拉氏构象图的允许构象和不允许构象区域，如图4所示。 图中每个点代表一个氨基酸残基，红色点为组成α-螺旋的氨基酸，黄色为β-折叠。 由图4可知，α-螺旋主要集中于第3象限的允许区域内，而β-折叠主要集中于第2象限的允许区域内。

由此可证，CM16的二级结构主要由α-螺旋组成。只有6 个点位于不允许区域，8个点位于蓝色的临界区域，其他多位于黄色的允许区域内，允许区域的氨基酸覆盖率达88%，此结果表明，构建的CM16的三维结构在一定程度上具有合理性和稳定性。

利用Pymol软件对生物信息学模拟的CM16线性B细胞表位在其空间结构上进行定位，将生物信息学模拟的4 条线性B细胞表位按不同颜色标注在三维结构图上（图5）。图5A为卡通拓扑图，彩色区域是不同抗消化肽段在其中的定位。CM16的空间结构是由4 个分子内的α-螺旋以及其他无序结构组成的，具有醇溶蛋白超家族典型的结构特性。由二硫键形成α-螺旋在维持蛋白质空间结构稳定性方面起到非常重要的作用，使CM16蛋白形成致密的球状分子，为其致敏性提供了结构基础。除标注为红色的表位位于α-螺旋上以外，其他的3 个表位均位于无规卷曲处，构象上具有可塑性，容易与抗体接触形成表位。图5B显示CM16表面分子暴露情况，4 个预测的线性表位均位于球状结构表面，具有与抗体结合的表面可及性，可以形成线性B细胞表位。综上可知，CM16的线性B细胞表位多位于无规卷曲处或是α-螺旋与无规卷曲的连接处，具有可塑性及表面可及性。

5. 过敏原CM16可能线性B细胞表位与抗消化肽段的比较

将小麦蛋白粗提物经胃蛋白酶消化60 min后的产物，通过高效液相色谱-质谱联用进行鉴定。经过60 min的胃蛋白酶消化，共产生6 753 个二级质谱图。根据Uniprot数据库提供的小麦过敏原氨基酸序列构建检索数据库，使用pFind软件搜索，共鉴定出23 条属于过敏原蛋白的片段。

将预测表位与抗消化肽段在过敏原CM16的一级氨基酸序列上分布进行标注，如图6所示，预测表位和抗消化肽段主要分布于中部和C末端，而1、2号抗消化肽段与2、3号预测表位有部分序列重合，证明了预测表位的抗消化性，也体现了表位与抗消化肽段之间的联系。

讨 论

本研究首先对小麦蛋白质粗提物进行电泳分析，发现分子质量在17 kDa的小麦过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16量最高，约占总蛋白含量的40%。进一步进行体外模拟胃肠道分析，结果显示小麦过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16在模拟消化过程中会产生消化抗性片段，提示其可能具有潜在的致敏活性。为研究小麦中的醇溶蛋白超家族过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的线性B细胞表位的结构特征，通过生物信息学方法对小麦过敏原CM16的线性B细胞表位进行探究。首先通过DNAStar对CM16一级氨基酸序列进行分析，通过筛选，最终确定了4 个CM16的线性B细胞表位。

本研究进一步通过生物信息学预测CM16的二级结构，并通过同源建模确定CM16的三级结构。在进一步完善线性B细胞表位预测研究的基础上，深入研究了线性表位的构象分布。结果表明，CM16是由4 个α-螺旋以及无规卷曲组成的球状结构，预测的线性B细胞表位则位于无规卷曲处或是α-螺旋与无规卷曲的连接处，且暴露于球状结构的表面，具有表面可及性及结构可塑性。

为探究生物信息学方法预测线性B细胞表位的抗消化肽段的可行性，本研究利用生物信息学方法预测出CM16的4 条线性B细胞表位后，结合质谱得到的抗消化肽段信息进行比对分析，发现其中2 条肽段存在部分重合，含有线性B细胞表位的可能性更高，也证明了抗消化性结合生物信息学分析鉴定过敏原线性B细胞表位的方法的可行性和应用性。

结 论

小麦中的醇溶蛋白超家族过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16是由4 个α-螺旋以及无规卷曲组成的球状结构，其线性B细胞表位则位于无规卷曲处或α-螺旋与无规卷曲的连接处，且暴露于球状结构的表面，具有表面可及性及结构可塑性。 探究小麦过敏原CM16线性B细胞表位有助于进一步认识小麦过敏原，对小麦过敏原的识别和检测具有重要的参考和借鉴作用。

本文《小麦主要过敏原CM16线性B细胞表位的预测及初步鉴定》来源于《食品科学》2019年40卷24期136-141页，作者：李雪娇，李欣芮，范卓妍，张亚妮，车会莲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181023-251。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在成功召开“2019年动物源食品科学与人类健康国际研讨会（宁波）”的基础上，将与青海大学农牧学院于2020年6月20-21日在西宁共同举办“2020年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。研讨会将就肉、水产、禽蛋、乳制品等动物源食品科学基础研究、现代化加工技术，贮藏、保鲜及运输，质量安全与检测技术，营养及风味成分分析，副产物综合利用，法律、法规及发展政策等方面的重大理论研究展开深入探讨，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。