Cell 重要进展 | 叶形态发育和多样性的分子机制被揭示！

生物多样性主要体现在物种的丰富性。从形态学角度看，物种多样性表现在物种不同组织器官的形态差异性，相同物种具有类似组织结构形态而不同物种之间则存在明显差别。早期生物分类学研究的依据主要来自生物组织器官结构的形态差异。虽然随着研究方法的更新与发展，例如分子生物学、基因组学等方法介入，生物分类学得到长足发展，然而生物形态结构依然是最根本的判断依据。

植物叶片形态是植物分类的主要依据，同时也是研究植物多样性的理想模型。植物叶片分类有很多种，根据叶柄上着生叶子数量可以分为单叶和复叶（下图）【1】。根据叶片叶缘形态，单叶又可以分为叶缘平整无裂叶片（如拟南芥第一个真叶）、含有一些小的浅裂叶片（如成熟的拟南芥叶片）以及大的深裂叶片（如琴叶拟南芥叶片）等叶形分类。复叶根据叶柄上着生的小叶情况分为羽状复叶（如碎米荠叶片）以及二回羽状复叶（如番茄叶片）等。从形态上观察单叶叶柄上只着生一个叶片，当叶片上出现全裂的叶缘时，其形态类似复叶。

叶片形状的多样性是由叶缘的改变而产生的。近年来，一些基因影响叶形态发育的分子机制被逐步揭示。2008年，法国国家农业研究所Patrick Laufs团队发现边界基因NAM/CUC (NO APICAL MERISTEM / CUP-SHAPED COTYLEDON)调节叶缘发育【2】。该研究中，研究人员发现在4种较远缘双子叶植物中CUC基因在相应的物种中具有相似表达模式（均在远端小叶原基边界表达），沉默及突变相应的CUC同源基因均导致抑制叶边缘生长，结果减少小叶的数量甚至融合成为一个叶片。2014年，德国马普育种研究所Miltos Tsiantis团队通过比较两个较近物种拟南芥与碎米荠的叶子形态（上图），通过遗传筛选在碎米荠中鉴定到一个影响叶边缘发育的基因RCO (REDUCED COMPLEXITY )【3】。RCO是在十字花科植物中通过基因复制进化而来的，而在十字花科植物拟南芥中丢失，表明该基因是影响单叶与复叶形态发育差异的关键基因。该基因的鉴定揭示了在进化过程中通过调控基因的复制和丢失相结合，产生了叶片形态多样性。

虽然在一些物种中调节器官多样性的关键基因被发现，然而植物器官在细胞水平发育的差异是如何体现的，基因是如何通过影响细胞生长来调节植物器官形态以及在进化过程中基因的活性如何改变生长、发育模式以及分化产生器官的多样性等等问题尚不清楚。近日，德国马普育种研究所Miltos Tsiantis团队在Cell期刊上发表了题为A Growth-Based Framework for Leaf Shape Development and Diversity的研究论文。该研究主要通过实时成像、建模和遗传学方法解析了在细胞水平上呈现出拟南芥的单叶与碎米荠的复叶发育的差异性，发现了叶的形态产生依赖两种生长模式：细胞分化广泛存在在器官中的生长模式以及叶缘局部定向的生长模式。最终揭示两种叶形差异由两个关键的同源盒结构基因STM (SHOOTMERISTEMLES)以及RCO的活性所决定的。

Miltos Tsiantis研究团队主要利用遗传学、生物成像、基因组学和构建模型等方法相结合，试图解决生物学中的两个基本问题：生物形式是如何发展的，以及它们多样性的基础是什么。

该研究中，研究人员为了简化研究过程，选取了相对简单的拟南芥单叶以及碎米荠复叶为研究对象。通过延时摄像记录两个不同物种叶片从出现到7-8天（DAI, days after initiation）的细胞生长发育全过程，并且根据以前数据构建了完整叶细胞谱系图。为了更好直观体现细胞谱系发育过程，研究人员量化了细胞生长参数，包括：生长量（细胞区增长的速率）、方向性（细胞主要生长的方向）以及细胞的增殖。为了评估组织的分化程度，研究人员还测量了细胞大小、气孔密度以及平面细胞的几何机构等数据。通过这些数据，研究人员发现两个物种叶片在细胞水平的生长差异最终导致叶形态不同。虽然叶形差异较大，但是它们发育具有三个共同生长特征：（1）叶片起始发育（1-3 DAI）期间，叶原基生长具有均匀性和各向异性（细胞生长方向差异大）；（2）起始发育之后（约3-4DAI），叶边缘生长发育模式的建立伴随叶缘突起的产生；（3）接着，与向基性（basipetal）分化过程相关且组织依赖性生长模式出现主要包括发生在叶片中的各向同性生长和同时发生的叶周围边缘、中脉和叶柄的各向异性生长。

为了鉴定细胞生长分布的差异产生这些不同的叶形，研究人员计算并比较了两个物种从3到7天（3-7 DAI）中生长和增值的细胞系。发现在碎米荠叶片中生长增殖的细胞主要在远端而拟南芥叶片主要发生在基端。这个差异可能与碎米荠叶片增加叶缘生长以及整体延迟分化有关。为了进一步研究两个物种叶形差异，研究人员分析了两种叶缘产生突起的差异。结果表明，复叶与单叶不同主要体现三个关键之处：(1) 突出生长起始位置不同（复叶在中脉而单叶在叶片上）；(2) 抑制叶缘产生突起的基部生长位置不同；(3)整体生长模式的改变不同，即碎米荠中，整体细胞分化相比拟南芥较迟。这与在碎米芥叶片中外侧面和远端生长增加以及减少近端和内侧区域为特征的生长从而产生小叶有关。因此，整体细胞分化因素和局部细胞生长因素相互作用影响叶片生长从而产生叶形的差异。

已有研究表明生长素极性分布影响叶突起的形成，该研究也证明了该结论。通过表达定位发现，PIN1主要在拟南芥叶片突起处特异表达。进一步发现在拟南芥中抑制生长素的转运以及PIN1的缺失突变均不会产生叶缘突起，这与CUC2缺失突变表型一致。从而提出了拟南芥叶缘发育模式可能是由Auxin-PIN1-CUC2分子模块调控的。为了研究该分子模块调控叶缘模式与叶片生长的关系，研究人员通过建模与延时摄像结合的方法发现了由于PIN1的运输，生长素在突起处积累达到最高浓度使得生长加速，而临近处CUC2特异表达的组织生长受到抑制，这种差异生长促使叶缘突起的产生。该结果表明，生长素、PIN1以及CUC2参与的叶缘生长模式调节叶片局部生长从而影响拟南芥叶形。

研究人员还通过探讨了影响突起生长的参数揭示整体以及局部生长是如何相互作用产生碎米荠的小叶形态。研究结果发现两个核心基因包括局部作用的RCO以及整体作用的STM相结合从而增加叶片复杂性。STM主要参与植物叶片整体细胞增殖与分化，而RCO在小叶发生起始基部表达从而局部抑制非小叶组织中细胞的生长从而调节碎米荠叶缘发育过程。拟南芥中分别异位表达STM与RCO均会使叶缘产生异常且多的突起而在碎米荠中缺失两个基因都会对均影响小叶的形成。这些结果表明，叶片分化减缓以及细胞缓慢生长能够维持叶缘产生更多的突起。

总的来说，拟南芥单叶与碎米荠复叶叶形态差异主要体现在：1. 叶片整体上碎米荠的分化程度低于拟南芥；2. 在细胞水平上，碎米荠细胞增殖主要在远端拟南芥叶片细胞增殖主要在基部叶片组织中；3. 在基因网络调控水平上，碎米芥叶片中特异表达基因STM以及RCO相互作用直接导致复叶形态中小叶的产生。结合Auxin-PIN1-CUC2分子模块调控叶缘发育的因素，研究人员构建了植物从叶缘无裂的完整单叶通过植物内源信号调控以及基因选择性表达相结合逐步发育产生复叶的过程，这为叶形态进化差异过程提供分子依据。

综上，该研究通过延时摄像与遗传学方法并辅助计算机建模揭示了基因表达的差异性影响细胞生长过程，最终导致两个物种中单叶与复叶形态产生差异的原因，并且通过在基因表达上的修饰，在拟南芥中再现了类似碎米荠复叶的形态。该研究首次从细胞水平完整展现了单叶与复叶的精细发育过程，为更加复杂的整体植物多样性提供方法及理论基础。同时，随着植物研究新方法的应用包括单细胞测序、基因组学以及延时摄像技术等，给植物形态发育与进化研究注入了更强生命力。

碎米荠简介：碎米荠（拉丁名字：Cardamine hirsuta）属于十字花科，一年生草本，高6-25厘米，无毛或疏生柔毛。茎1条或多条，不分枝或基部分枝。基生叶有柄，单数羽状复叶，小叶1-3对，顶生小叶圆卵形，长4-14毫米，有3-5圆齿，侧生小叶较小，歪斜，茎生叶小叶2-3对，狭倒卵形至条形，所有小叶上面及边缘有疏柔毛。总状花序在花时成伞房状，后延长；花白色，长2.5-3毫米；雄蕊4(-6)。长角果条形，长18-25毫米，宽约1毫米，近直展，裂瓣无脉，宿存花柱长约0.5毫米；果梗长5-8毫米；种子1行，长方形，褐色。分布在沿长江一带，东至福建，西南至云南；亚洲其他地区，欧洲，非洲及美洲也有。生于草坡或路旁。

碎米荠图鉴（来源网络）

参考文献

【1】Runions, A., and Tsiantis, M. (2017). The shape of things to come: From typology to predictive models for leaf diversity. American Journal of Botany 104, 1437-1441.

【2】Blein, T., Pulido, A., Vialette-Guiraud, A., Nikovics, K., Morin, H., Hay, A., Johansen, I.E., Tsiantis, M., and Laufs, P. (2008). A conserved molecular framework for compound leaf development. Science 322, 1835-1839.

【3】Vlad, D., Kierzkowski, D., Rast, M.I., Vuolo, F., Dello Ioio, R., Galinha, C., Gan, X.C., Hajheidari, M., Hay, A., Smith, R.S., et al. (2014). Leaf Shape Evolution Through Duplication, Regulatory Diversification, and Loss of a Homeobox Gene. Science 343, 780-783.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.011