PD-1和PD-1抗体的故事：从发现到临床应用

来源@药事纵横

作者@文竹

导读：

细胞程序性死亡受体1（简称PD-1或Pdcd1）是属于CD28 / CTLA-4家族的免疫受体,通过与PD-L1或PD-L2的相互作用,募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2负调节抗原受体信号的传导，进而对宿主免疫反应起到负调节作用。自首个治疗癌症的PD-1-PD-L1抑制剂上市以来, 因其优越的临床治疗效果，广泛的适用范围，较低的毒副作用等临床优势使得PD-1/PD-L1的研究开发热度一直不减。但早期的PD-1-PD-1研究过程充满了波折。接下来小编就为大家介绍一下PD-1/PD-L1的相关研究历史。

1PD-1，PD-L1和PD-L2的历史

1）PD-1的发现

1992年日本科学家Honjo发现了两种会发生程序性死亡的细胞系：造血祖细胞系LyD9(IL-3缺失后可引发细胞程序性死亡）和T细胞杂交瘤2B4.11（通过用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯和离子霉素刺激而引发细胞程序性死亡）。因为这两种细胞的凋亡都需要 RNA重组和蛋白质合成，所以研究人员试图将两种细胞进行消减杂交方式建立了这些 RNA和蛋白质的基因库并鉴定了PD-1的 cDNA。但当时因为有更热门的免疫蛋白CTLA-4、CD86和CD80的存在，所以当时PD-1并没有引起重视。

2）鉴定PD-1的配体

为鉴定PD-1的配体，1993年时曾有研究者首先合成了能与PD-1配体结合的PD-1的融合蛋白（PD-1-Ig），想通过克隆PD-1-Ig融合蛋白的策略分离配体的cDNA，但均未获得理想的结果。直到1999年，陈列平教授首先发现了B7家族的第三个成员B7-H1（即PD-L1），但当时陈教授并未发现与之结合的PD-1，因此并没有发现PD-1/PD-L1通路的作用。

随后到2000年，Tasuku Honjo和Gordon Freeman等在哈佛大学鉴定了新的B7分子（克隆129），并发现了其与PD-1的相互作用。PD-1与克隆129的结合可抑制抗CD3抗体刺激后的T细胞增殖和细胞因子分泌，随后克隆129的名称被改为PD-L1用于表示PD-1的配体1，Tasuku Honjo等还进一步确定了另一种配体PD-L2。 PD-L1的鉴定将PD-1作为其第三成员添加到CD28家族的列表中（图1）。

图-1 CD 28家族成员及其配体概述。包括：名称、表达模式和功能。其中Act表示激活后表达；const表示组成型表达。

2PD-1及其配体的结构和表达

1） PD-1

当1999年以后，科学家才将目光逐渐转移到PD-1上，经研究发现PD-1是50-55-kDa的I型跨膜糖蛋白，其由IgV型细胞外结构域与CTLA-4，CD28和ICOS共享21-33％的同源序列。还发现 PD-1缺乏CD28家族其他成员同源二聚化所需的膜近端半胱氨酸残基，PD-1在溶液中以及在细胞表面上是单体形式存在。PD-1细胞质结构域具有两个酪氨酸残基，分别参与组成了免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIM）和免疫受体酪氨酸的开关基序（ITSM）。其中位于ITSM内的酪氨酸残基对PD-1的抑制功能是必需的。

通过对PD-1的表达部位的研究发现其在胸腺中的双阴性α β和γ δ T细胞上表达，并在激活后在外周T细胞和B细胞上诱导。 Pd-1除了在细胞表面表达外，在具有调节功能的T细胞的细胞质中也可以检测到Pd-1。PD-1的广泛表达与其他CD28家族成员在T细胞上的限制性表达形成明显对比，这表明与其他CD28家族成员相比，PD-1可调节更广范的免疫应答反应。

2）PD-L1和PD-L2

PD-L1和PD-L2是由IgC-和IgV-型细胞外结构域组成的I型跨膜糖蛋白。PD-L1和PD-L2 的氨基酸序列40％具有同源性。 PD-L1和PD-L2的氨基酸序列与B7.1（CD28的配体）和B7.2（CTLA-4的配体）有约20％同源。

多种正常组织均表达PD-L1和PD-L2的转录物，并在胎盘，心脏，肺和肝脏中具有高表达，在脾脏，淋巴结和胸腺中低表达，在脑中不表达。在正常情况下，非淋巴器官中很少检测到PD-L2蛋白。 PD-L1在淋巴组织和非淋巴组织中表达，表明PD-1-PD-L1途径可调节次级淋巴器官以及靶器官中的免疫应答。

PD-L1在静息B细胞，T细胞，巨噬细胞和树突状细胞（DC）上表达。 通过各种刺激可使PD-L1在这些细胞上的表达可进一步上调。 PD-L2很少在静息细胞上表达，也很难在B细胞和T细胞上诱导。 另外， PD-L1和PD-L2也在各种肿瘤细胞系和免疫特权部位表达。

3PD-1/PD-L1通路与自身免疫

虽然科学家在1992年就发现了PD-1，但随后的实验并未证实PD-1直接参与细胞的程序性细胞死亡，直至1999年，首个PD-1缺陷小鼠研究模型出现后，人们才发现PD-1在免疫调节过程中的作用。

1999年科学家通过对C57BL / 6-PD-1缺陷小鼠的研究发现，与野生型C57BL / 6小鼠相比，C57BL / 6-PD-1缺陷小鼠表现出免疫系统的过度激活现象，并在生活中出现类似狼疮的炎症和肾小球肾炎。随后科学家通过对BALB / c- PD-1缺陷小鼠模型的研究发现，PD-1的缺陷可导致自身免疫性扩张型心肌病（DCM）。

而通过研究非肥胖糖尿病（NOD）的PD-1缺乏症小鼠和NOD-PD-L1缺陷小鼠的动物模型发现，PD-1或PD-L1缺乏均可显著加速糖尿病的发生和发病。母体通过PD-1-PD-L通路抑制母体免疫系统来实现胎儿 - 母体耐受。在心脏异体移植排斥过程中，增强CD4和CD8T细胞上的PD-1表达可抑制排斥反应延长同种异体移植物的存活时间。

基于上述研究结果，科学家曾进行了运用表达PD-L1的树突状细胞（DCs）来治疗自身免疫性疾病的试验。试验结果显示给小鼠注射表达PD-L1的树突状细胞（DCs）后，小鼠的脊髓炎症反应及临床实验性脑脊髓炎(EAE)的严重程度均明显减轻。

另外，科学家使用表达小鼠PD-L1全长基因（Ad.PD-L1）的重组腺病毒递送PD-1信号治疗BXSB小鼠的狼疮样综合症的试验结果显示Ad.PD-L1可一定程度上阻止肾炎的发展，具体表现为蛋白尿的频率较低，血清抗dsDNA IgG的量减少和肾病理改善。当时这些研究都为通过调控Pd-1的抑制功能来治疗自身免疫性疾病提供了新的依据。

4 PD-1/PD-L1通路与病毒感染

2003年，科学家用表达LAKZ的腺病毒作为模型病毒攻击PD-1缺乏的小鼠，结果显示大多数野生型小鼠的肝细胞感染了表达LacZ的腺病毒，而在PD-1缺乏的小鼠中，只观察到少量的LacZ阳性细胞。并在30天后，Pd-1缺乏的小鼠肝脏未见LacZ阳性细胞，肝细胞完全再生，说明PD-1-Pd-L1通路抑制肝脏的抗病毒免疫反应。

另外，2006年科学家还发现PD-1在HIV特异性CD8 T细胞上高表达，其表达水平与疾病进展、病毒载量增加以及CD4 T细胞减少有关。阻断PD-1可以恢复HIV特异性CD8 T细胞的功能，促进CD8 T细胞的增殖和细胞因子产生。2017年法国一家研究机构发现，PD-1抑制剂可以消除病人体内的HIV感染细胞（即HIV病毒储库），这一研究为艾滋病的治疗结果从病情控制向完全治愈提供了可能。同样的在乙型肝炎病毒感染的患者中也发现了高表达PD-1的CD8 T细胞失能现象。这些研究为PD-1阻滞剂在慢性传染病的未来应用提供了光明的前景

表-1 pd-1和pd-L1在人类感染性和自身免疫性疾病中的异常表达

5 PD-1/PD-L1通路与肿瘤

PD-L1在大多癌症细胞上高表达（表-2），而 PD-1 在肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤特异性 T 细胞及一些与损伤相关的T细胞中高表达。2002年，陈列平教授首次证明了肿瘤细胞通过表达PD-L1实现免疫逃逸，阻断PD-L1可恢复T细胞的癌症免疫反应。

这项研究发现为开发PD-1/PD-L1药物用于癌症治疗提供了重要理论依据。随后科学家使用的各种系统（如PD-1和PD-L1的抗体阻断，PD-L1 缺失小鼠，PD-1 缺失小鼠，肿瘤特异性T细胞克隆，TCR转基因小鼠等）进一步证明了PD-1-PD-L1阻断通路可以恢复肿瘤宿主的免疫受损状态并激活宿主免疫系统。

表-2 PD-L1和PD-L2在人癌组织中的表达

陈列平教授

6PD-1/PD-L1抑制剂的开发

现已上市PD-1/PD-L1药物中最为大家熟知的两个药物便是Opdivo和Keytruda。两个药物最早分别由美国制药公司Medarex和荷兰制药公司Organon开发。这两个药物开发过程中各自都经历了几多波折，上市后彼此之间又临着既生瑜何生亮的宿命。

早在2001年Medarex公司就开始考虑布局PD-1/PD-L1药物的开发。由于PD-1在当时仍属全新领域，抗PD-1药物的体外评价方法和动物肿瘤模型的研究报道更是一片空白。所以项目的进度较慢，直到2004年底才完成PD-1/PD-L1药物的开发的体外评估方法和动物模型的建立。随后Opdivo的筛选、鉴定和动物模型评价过程才正式展开。由于Medarex公司无法绕不开2003年1月本庶佑和小野制药的申请的专利中的专利（7），以及药品开发过程的资金紧张的问题，2005年Medarex公司开始与日本小野制药合作开发Opdivo。

而荷兰制药公司Organon开发Keytruda的时间稍晚，2003年时Organon本着开发PD-1激动剂治疗免疫疾病的目的开始研究PD-1药物，但让Organon失望又意外的是直到2005年他们也没有找到PD-1激动剂而是找到了一系列的PD-1抑制剂。面对这种局面Organon很快调整战略，将研究方向指向了PD-1抑制剂的癌症免疫治疗，并在随后的2006年准备申请临床试验。

以此同时，Medarex公司的全球首个PD-1药物（Opdivo）的临床I期试验获的FDA批准，并开展了39名癌症复发的病人的临床试验。但随后的临床结果显示与传统药物相比，Opdivo在无进展生存期（患者肿瘤不进展情况下的存活时间）和客观响应率（肿瘤明显缩小的患者比例）方面都没有好太多。这样的临床结果使很多人开始质疑对PD-1-PD-L抑制药物的临床价值，甚至Medarex公司的管理层也产生了动摇，这直接促使2009年百时美施贵宝（BMS）以24亿美元的总价收购了Medarex，当时百时美施贵宝（BMS）看中的是另一个药物Yervoy，而不被重视的Opdivo几乎是半买半送。

另外值得一提的是Medarex公司也曾是首个开发PD-L1药物的制药公司，并与2008年获批了首个临床试验，但在临床结果出来后BMS就停止了对其的开发。这也使得罗氏的PD-L1药物的开发走在了最前面。

相对于开发之初BMS对Opdivo的忽视，Keytruda就显得更加命途多舛。在2006年Keytruda准备申请临床之后不久，Organon就于2007年被美国的Schering Plough收购，随后的收购过程使Keytruda的临床申请一度搁置。在收购完成之后，Keytruda又因前景不被看好而被再次搁置。但当时的研究者Van Elsa并没有放弃，通过积极游说终于使Keytruda的临床申请提上日程，但紧接着2009年Schering Plough又被默沙东收购了，之后默沙东通过分析Opdivo的前期临床结果认为Keytruda没有前景而放弃了后续的开发工作。

但后来人们才了解到，PD-1药物与传统抗癌药物不同，其临床优势要很长时间才能突显。随着Opdivo临床试验的后续跟踪，直到2010年PD-1药物Opdivo的临床治疗优势才正式显现出来，参与临床试验的病人中，一位结直肠癌患者实现了完全缓解，一位黑色素瘤患者和一位肾癌患者实现了部分缓解，另有两位黑色素瘤患者的肿瘤也得到了显著缩小。而后续2012年公布的临床结果却真正使抗PD-1药物在治疗癌症方面大放异彩。Opdivo在治疗癌症方面的突出表现使得PD-1/PD-L抑制药物受到行业的重视。其他公司纷纷意识到PD-1/PD-L抑制药物广阔前景，并开始开发自己的PD-1/PD-L抑制药物。

默沙东更是在2010年Opdivo的临床数据公布后就开始重新着手继续研究自己的PD-1抑制药物（Keytruda），并在2010年12月获得批准进入临床试验。正是由于2010年默沙东果断积极的重返PD-1/PD-L1抑制剂开发的赛道，才缩短了其与BMS在PD-1/PD-L1抑制剂开发进度上的时间差，进而才使Keytruda与Opdivo在市场竞争中实现弯道超车。2018年Keytruda的全球销售额反超Opdivo达到了71.71亿美元（Opdivo为67.35亿美元）。

2014年7月全球首个PD-1药物Opdivo在日本上市，同年12月，第二个PD-1药物Keytruda在美国上市，2016年首个PD-L1抑制剂上市。随后国默克公司与辉瑞的Bavencio，阿斯利康PD-L1单抗Imfinzi都分别在2017年上市，加上2018年上市的Libtayo，全球目前已有六个PD-1/PD-L1抑制剂药物上市，但是正在处于临床阶段的PD-1/PD-L1抑制剂玩家却已达几十个，可谓相当拥挤，未来PD-1/PD-L1抑制剂的价格大战想必会十分残酷。

避免价格战的其中一个方法就是适应症或销售市场的差异化，现在竞争最激烈的Opdivo和Keytruda已分别获批了包括黑色素瘤，非小细胞肺癌，头颈鳞癌等在内的10和11种适应症。但因为PD-1-PD-L1抑制剂单独用药的疗效并不高，所以现在PD-1-PD-L1抑制剂联合化疗药物，分子靶向药物的治疗方式将成为癌症治疗的主要方向。

另外， Opdivo和Keytruda已分别于2018年在我国上市。并且我国国内的两个仿制PD-1/PD-L1抑制剂特瑞普利单抗注射液和信迪利单抗也已上市。由于这四款药物在我国的上市时间较短，除了Keytruda和特瑞普利单抗注射液的因适应症相同（黑色素瘤）而存在直接竞争外，其他两种药物因彼此之间存在适应症差异，所以目前来看国内PD-1/PD-L1药物市场的竞争并不激烈。但是从四种药物的正在进行的临床试验数量和其他处于临床研究阶段的药物数量来看，将来国内的PD-1/PD-L1药物市场也将是一片腥风血雨。

7结语

在PD-1发现的前十年，PD-1的生物学功能一直是一个谜。直到PD-1缺乏小鼠的产生及其配体的发现扭转了这一局面。

自2000年以后，PD-1-PD-L1通路的功能才被被迅速地揭示出来。相应的体外评估方法，动物实验模型以及临床终点的划分都被逐步披露出来。

目前，PD-1-PD-L1抑制剂的研究成果主要集中在抗肿瘤领域，而其他领域的开发（如艾滋病治疗）稍显落后。但小编相信随着人们对PD-1-PD-L1通路的不断深入研究，治疗癌症和传染病的PD-1拮抗剂，以及治疗自身免疫性疾病、过敏和移植排斥反应的PD-1激动剂必将通过单独用药或联合用药形式在人类疾病治疗方面发挥作用。

图-2 PD-1激动剂和拮抗剂的临床应用。抑制不良免疫反应的PD-1激动剂可能有助于治疗自身免疫性疾病、过敏和移植排斥反应。增强免疫反应的PD-1拮抗剂可能对癌症和传染病有帮助。

参考文献：

【1】 Taku Okazaki and Tasuku Honjo，PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application，The Japanese Society for Immunology. 2007，International Immunology, Vol. 19, No. 7, pp. 813–824

【2】王水英，孙宁，金惠，程晓东，PD-1/PD-LS 信号通路在肿瘤免疫逃逸及治疗中的作用；医学综述 2013.06,19(2),1973-1975

【3】 ZOU W, CHEN L. Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment[J]. Nat. Rev. Immunol. 2008, 8(6): 467-477.

【4】QUEZADA S A, PEGGS K S. Exploiting CTLA-4, PD-1 and PD-L1 to reactivate the host immune response against cancer[J]. Br. J. Cancer, 2013, 108(8): 1560-1565.

【5】 Annals of Oncology, “Drastic decrease of the HIV reservoir in a patient treated with nivolumab for lung cancer”mdx696.Published:01 December 2017.

【6】 张继 ，第一个PD-1抗体：Nivolumab的开发故事，美中药源

【7】我们的故事——PD-L1/PD-1的历程， IO学社

【8】80后菠萝博士，O药研发史：22年接力，华人科学家功不可没！菠萝因子

【9】 张震，Keytruda一波三折的开发之旅及启示，美柏医建