基因编辑肌肉牛的诞生

2004年6月23日，《新英格兰医药杂志》（New England Journal of Medicine）报告了一个力量惊人的德国男童，这个男孩肌肉量是同龄孩子的两倍，脂肪组织却只有同龄孩子的一半。医生检测并未发现其激素或者生长因子的分泌异常，那么这名儿童为什么会天生神力呢？后来发现，男孩母亲曾是一位专业赛跑运动员，并且这个运动员妈妈的家人中不乏力量惊人的大力士。这种神秘的力量是怎么在这个家族之中进行传递的呢？对男孩DNA检测发现，这个男孩的一个特殊的基因存在着功能缺失，发生变化的基因被称为“myostatin（MSTN）”，它是肌肉组织生长的一个抑制因子，所以当这个基因功能缺失的时候会使得肌肉组织迅速发育，从而使肌肉格外强壮。
肌肉生长抑制素基因的神秘面纱在1997年就被揭开了，McPherron 、Lee等科研工作者的小鼠研究表明，如果这个基因的功能出现了问题，小鼠的肌肉重量会变成正常小鼠的2至3倍，这种肌肉重量的增加不仅仅与肌肉细胞数目的增多有关，更重要的是肌纤维也会变得更粗（图1）。

图 1 MSTN基因敲除小鼠（下）与野生型小鼠（上）相比对比图
（a）面部（b）前肢（c）后肢（d）胸部。
更为有意思的是，早在MSTN走入科学家的视野以前，这个基因就已经悄悄的溜入了人们的生活之中。在畜牧业的发展过程中，牛有着劳役、提供乳肉等多种用途，所以人们对于牛的筛选倾向于肌肉轮廓分明、形体健壮的牛。在这个需求的漫长选择中，MSTN功能缺失所引起的骨骼肌肥大逐渐被人们发现了，并且在扩繁与筛选的过程中得到了壮大。
这其中包括皮尔蒙特牛。皮尔蒙特牛是意大利知名的肉牛品种。它和大多数的肉牛品种有着相似的经历，都是由役乳逐步向肉乳兼用、肉用的方向发展而来（A）。在图片（图2）中我们可以看到，皮尔蒙特牛肌肉体型健硕、肌肉线条明显，皮下脂肪少；在屠宰、解剖分解过程中更是可以见到双脊背和双臀。正是这种明显不同的肌肉肥大，常常称为双肌肉。

图2 皮尔蒙牛
与皮尔蒙特牛很像，在图3中我们可以看到比利时蓝牛也是肌肉相当的丰满，胸部、颈部以及臀部肌肉厚实，由于脂肪量很低，所以肌肉块轮廓清晰可辨。这种体形健硕的“健美牛”是比利时肉牛的当家品种，它是由英国短角牛、荷兰牛与比利时本地牛经过培育发展而来的拥有优美线条的双肌肉肉牛(CF)，比利时蓝牛除了瘦肉率高外，适应性也很强，增重能力快，所以是公认的高生产性能的优良肉牛品种 (D)。

图3 比利时蓝牛
除了比利时蓝牛与皮尔蒙牛之外，夏洛莱牛、阿奎坦牛、利木赞牛以及德国黄牛也都是存在肌肉生长抑制素功能缺失。看到这些洋气的名字，你肯定好奇了，中国的肉牛呢？
由下面这张图（图4）不难看出，我们国家有着比较丰富的品种资源。但是在实际养牛生产中却存在着不少的问题，特别是在养殖效益和肉类生产指标方面和发达国家仍存在较大差距。畜牧业是我国农业经济发展和增长的重要因素，培育优良品种是提高我们畜牧业竞争力必不可少的一部分。那么是否有可能既能利用我们国家丰富的品种资源，同时快速生产出优良品种呢？

图4 中国奶牛品种（引自新牧网）
研究人员就想到了在鲁西黄牛的基础上，利用生物学技术对MSTN基因进行操作，从而培育高产肉率、高屠宰率的转基因肉牛新品种。这样一来，既可以保持鲁西黄牛原有的优良性状，又能大大缩短育种周期。正是在这种理念的指导下，MSTN敲除鲁西牛的中国新品种应运而生。这是首次利用生物技术培育这种“双肌”高品质肉牛。由图片我们可以看到MSTN敲除牛，肌肉线条明显，体型更为健硕（图5）。

图 5 MSTN敲除鲁西牛示意图
MSTN敲除鲁西牛（左）正常MSTN基因型鲁西牛（右）
这要经历获得MSTN被破坏的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞系、体细胞核移植以及克隆牛生产等几个重要过程。
其中获得MSTN被破坏的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞系的过程中包括对于对锌指核酸酶进行设计、建立鲁西黄牛胎儿成纤维细胞系等一系列过程。基因编辑是借助于细胞自身的DNA损伤修复机制对目标基因进行操作的过程，利用锌指核酸酶对MSTN进行基因操作，最终实现基因敲除/敲入。
因为这一项研究的目的是为了服务农业生产，与我们未来的食物息息相关，所以对MSTN基因进行破坏的同时绝对不能影响牛的其他的基因。所以采用的是更为安全的mRNA来转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞系。

图 6 ZFNs 介导 myostatin 基因敲除阳性细胞的筛选与鉴定的基本过程
得到MSTN基因被破坏的细胞后，为了实现从细胞到牛的一个神奇的转变，就需要用到克隆技术。首先将这种体细胞移入已去核的卵母细胞透明带内，并使它们融合。

图 7 体细胞核移植
细胞融合后，则需要挑选适宜的黄牛，将克隆的胚胎移植到黄牛的子宫，这样黄牛就可能产下MSTN 基因被破坏的克隆牛了。

图8 克隆胚胎的移植与myostatin 基因敲除克隆牛生产
MSTN基因敲除克隆鲁西黄牛的诞生为我们培育高品质肉牛新品种提供了优良的育种材料。这对填补国内在高品质牛肉上的缺乏、提高人民的生活质量、保障我国畜牧业的健康可持续的发展意义非凡。

作者介绍：孟庆勇，中国农业大学生物学院