【前沿进展】PNAS：中国学者首次解析草鱼呼肠孤病毒内部聚合酶复合物和核酸的三维结构

导 读

草鱼呼肠孤病毒（GCRV）是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，拥有自主知识产权，也是国际上研究得最为系统的水生动物呼肠孤病毒。近日，中国科学院武汉病毒研究所方勤研究员与湖南师范大学刘红荣教授及清华大学生命科学学院程凌鹏副研究员等人合作，在国际上首次解析了双层二十面体衣壳草鱼呼肠孤病毒内部聚合酶复合物和核酸的三维结构，为进一步阐明双链RNA病毒内部结构及病毒复制和转录机制提供了丰富的结构信息。相关研究于2018年6月25日在线发表于美国科学院院刊PNAS（Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, USA）上，题为 “Structureof RNA polymerase complex and genome within a dsRNA virus provides insightsinto the mechanisms of transcription and assembly”。

Fig. 1. Structures of the aquareovirus genome and RdRp complex within the capsid (filtered to 8- resolution).

研究背景

病毒三维结构研究已有50多年，之前的研究仅聚焦在病毒外部二十面体对称衣壳蛋白结构，而其内部核酸结构通常被认为是柔性无固定结构。
2015年刘红荣与程凌鹏在国际上首次解析并报道了单层衣壳的双链RNA基因组的呼肠孤病毒科病毒CPV内部基因组及相关蛋白结构（Sciences，2015，Vol）349.1347-1350）。
草鱼呼肠孤病毒（GCRV）为我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，拥有自主知识产权，也是国际上研究得最为系统的水生动物呼肠孤病毒。本研究在国际上首次解析了双层二十面体衣壳草鱼呼肠孤病毒内部聚合酶复合物和核酸的三维结构，为进一步阐明双链RNA病毒内部结构及病毒复制和转录机制提供了丰富的结构信息。

结果速览

本研究利用200kV加速电压的冷冻电镜与对称失配三维重构技术，解析了水生呼肠孤病毒/草鱼呼肠孤病毒近原子分辨的完整结构，包括病毒颗粒外部双层二十面体对称的衣壳和衣壳内部非二十面体对称的聚合酶、辅助蛋白及病毒核酸结构，精确阐述了聚合酶及其复合物与核酸、衣壳蛋白之间复杂的相互作用及精细的结构信息，研究了该病毒衣壳蛋白通过构象变化来协调聚合酶的复制与转录状态切换的机制。
该工作是目前所报道的用200kV电镜获得的尺度最大的生物大分子复合物的近原子分辨率结构（由1500多个蛋白聚合成的超过800A直径的颗粒，最好的区域结构分辨率为3.1A）

Fig. 2. Structures of VP2, VP4, and VP3A.
研究表明呼肠孤病毒科病毒的RNA聚合酶和基因组排列为一个不完整的二重三次对称，其双链RNA分层状排列，相邻的RNA平行排列。本研究进一步否定了近二十年来占据双链RNA病毒研究领域的“病毒衣壳内的RNA基因组和聚合酶呈线轴状排列”这一主流观点，为阐明双链RNA病毒的复制和转录的分子机制提供了结构基础。

结 语

本研究在国际上首次解析了双层二十面体衣壳草鱼呼肠孤病毒内部聚合酶复合物和核酸的三维结构，为进一步阐明双链RNA病毒内部结构及病毒复制和转录机制提供了丰富的结构信息。本研究得到了国家自然科学基金委及病毒学国家重点实验室开放课题等项目资助。中国科学院武汉病毒研究所方勤研究员、湖南师范大学刘红荣教授及清华大学程凌鹏研究院为本文的通信作者，湖南师大研究生王勖荣、中科院武汉病毒所助理研究员张付贤为本文共同第一作者。

ABSTRACT

Most double-stranded RNA (dsRNA) viruses transcribe RNA plus strands within a common innermost capsid shell. This process requires coordinated efforts by RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) together with other capsid proteins and genomic RNA. Here we report the near-atomic resolution structure of the RdRp protein VP2 in complex with its cofactor protein VP4 and genomic RNA within an aquareovirus capsid using 200-kV cryoelectron microscopy and symmetry-mismatch reconstruction. The structure of these capsid proteins enabled us to observe the elaborate nonicosahedral structure within the double-layered icosahedralcapsid. Our structure shows that the RdRp complex is anchored at the inner surface of the capsid shell and interacts with genomic dsRNA and four of thefive asymmetrically arranged N termini of the capsid shell proteins under the fivefold axis, implying roles for these N termini in virus assembly. The binding site of the RNA end at VP2 is different from the RNA cap binding site identified in the crystal structure of orthoreovirus RdRp λ3, although the structures of VP2 and λ3 are almost identical. A loop, which was thought to separate the RNA template and transcript, interacts with an apical domain of the capsid shell protein, suggesting a mechanism for regulating RdR preplication and transcription. A conserved nucleoside triphosphate binding site was localized in our RdRp cofactor protein VP4 structure, and interactions between the VP4 and the genomic RNA were identified.

参考文献：

1. Xurong Wang, FuxianZhang, Rui Su, Xiaowu Li, Wenyuan Chen, Qingxiu Chen, Tao Yang, Jiawei Wang,Hongrong Liu, Qin Fang, and Lingpeng Cheng. Structure of RNA polymerase complexand genome within a dsRNA virus provides insights into the mechanisms oftranscription and assembly. PNAS June 25, 2018. 20180388.

https://doi.org/10.1073/pnas.18038851152.

2.中科院武汉病毒所官网：

武汉病毒所研究获得草鱼呼肠孤病毒衣壳内部的核酸和聚合酶复合物结构http://www.whiov.ac.cn/kyjz_105338/201807/t20180704_5037344.html

本期编辑：Annabella