双齿围沙蚕抗凝血肽的制备及其抗血栓作用

血栓形成是缺血性心脏病、缺血性中风及静脉栓塞常见的病理学基础，严重危害人类健康且近年来还有渐增之势。双齿围沙蚕俗称海蜈蚣，与陆地生物蚯蚓具有很近的亲缘关系。国内外学者先后从沙蚕中提取出具有溶栓活性的丝氨酸类纤溶酶，但通过酶解的方法从沙蚕体内提取抗凝成分以抑制体内血栓，鲜见报道。

来自浙江海洋大学食品与医药学院的郑媛媛、丁国芳和杨最素等人从舟山朱家尖地区的双齿围沙蚕中分离纯化获得具有抗凝活力的沙蚕寡肽，并探讨其对实验性血栓形成及血小板聚集率的影响。

1 最佳酶的选择

在最适酶解条件下，碱性蛋白酶的酶解效果最好，抗凝活力达到了（69.0±2.3） U/g，胃蛋白酶次之。故选定碱性蛋白酶为本实验最佳酶。

2 PAAP的分离纯化结果

2.1 超滤分离纯化结果

取各个不同分子质量范围冻干样品测定抗凝活力，分子质量≤3 kD的酶解物抗凝活力最高，为（84.0±2.3） U/g，故选定该分子质量范围的酶解物进行下步分离纯化。

2.2 琼脂糖凝胶阴离子交换层析分离纯化结果

取分子质量≤3 kD的酶解液进一步分离纯化，于280 nm波长处出现3 个峰，收集各峰组分，冷冻干燥后测定抗凝活力，峰3组分具有最高的抗凝活力，为（900±51） U/g，故选择峰3对应的组分进行下一步分离纯化。

2.3 葡聚糖凝胶G-25层析分离纯化结果

取2.2 节中峰3 冻干样品进行凝胶过滤层析分离并在280 nm波长处检测吸光度，并收集此峰组分并冻干备用。

2.4 RP-HPLC分离纯化及氨基酸序列测定结果

G-25 洗脱峰冻干样品经RP-HPLC色谱柱洗脱纯化，共得到8 个单峰，由于峰1、8 组分产率不高，多次收集后仍然很少，因此未进一步收集，收集其他6 个峰组分并测定抗凝活力。其中峰4 组分具有最高抗凝活力，将峰4组分继续经RP-HPLC色谱柱洗脱纯化，得到1 个单峰，收集最高峰组分并将其命名为PAAP。经检测该目标肽的氨基酸序列为Pro-Val-Glu-Arg-Lys（脯氨酸-缬氨酸-谷氨酸-精氨酸-赖氨酸），分子质量为627.7 D。将该物质进行质谱分析，所得分子质量大小与该氨基酸序列的大小一致。经测定，PAAP的体外抗凝活力为（1 320.0±20.3） U/g。

3 急性毒理学实验结果

给予小鼠PAAP后，实验中各组小鼠活动正常、反应灵敏、皮毛光泽、进食和饮水等活动正常，精神状态良好且未出现死亡。解剖后发现，心、肺、肝、肾、胃和肠等器官肉眼观察均无异常。实验期间，PAAP实验组体质量和对照组相比较，实验组体质量涨幅相对明显，有统计学意义（P＜0.05）。

4 PAAP对体内血栓的影响 4.1 PAAP对不同时间角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓长度的影响

小鼠注射角叉菜胶后，各组均形成明显尾部血栓，随着处理时间的延长，各组的尾部血栓长度均有不同程度的缩短。造模24 h时，高、中剂量组与模型组差异显著，尾部血栓长度明显较短（P＜0.05）。48 h及72 h时，PAAP各组均与模型组有显著差异（P＜0.05）。阳性对照组与模型组差异不显著（P＞0.05）。

4.2 PAAP对大鼠颈动脉血栓的影响

阳性对照组与PAAP组均可减轻血栓质量。与模型组相比，PAAP中、高剂量大鼠的血栓质量显著下降（P＜0.05）。与阳性对照组相比，PAAP高剂量大鼠的血栓质量也有所下降，表明PAAP能够降低血栓质量且有量效关系。

5 PAAP对大鼠体内血小板聚集率的影响

与模型组相比，阳性对照组和PAAP各剂量组对ADP诱导的血小板聚集有非常显著的抑制作用（P＜0.05），且随着PAAP给药剂量的增加，抑制作用逐渐增强。

结 论

选取碱性蛋白酶作为最佳酶对沙蚕进行酶解，经过分离纯化后得到一条氨基酸序列：脯氨酸-缬氨酸-谷氨酸-精氨酸-赖氨酸（Pro-Val-Glu-Arg-Lys）。经测定，该寡肽的体外抗凝活力可达（1 320.0±20.3） U/g。PAAP的最大耐受量为11.0 g/（kg·d）且未出现小鼠异常及死亡现象，体内实验表明PAAP对小鼠尾部血栓的形成、大鼠动脉血栓的形成及ADP诱导的血小板聚集均有明显抑制作用。结论：从双齿围沙蚕中提取出的抗凝肽PAAP具有抗血栓作用。

本文《双齿围沙蚕抗凝血肽的制备及其抗血栓作用》来源于《食品科学》2017年38卷23期171-177页，作者：郑媛媛，丁国芳，杨最素，余方苗，贾盈露，吴宗泽，陈 锐。DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723027。图片来源于百度图片。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改：李莹 编辑/责编：张睿梅

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