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疾控中心团队论文:中国肺炎患者的新冠病毒

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本文于1月24日发表于《新英格兰医学杂志》

作者|高福(中科院院士,中国疾控中心主任)团队

翻译|王冠苏(网易财经 上海)

【综述

2019年12月,一群不明原因的肺炎患者被发现与中国武汉一家海鲜批发市场有关。通过对肺炎患者的样本进行无偏序测序,发现了一种以前不为人知的次冠状病毒(β-回旋病毒)。人类气道上皮细胞被用来分离一种新的冠状病毒,命名为2019-nCoV,它在sarbecvirus亚属,Orthocoronavirinae亚科(sarbecovirus的正冠状病毒亚科中)中形成一个分支。与MERS-CoV和SARS-CoV不同,2019-nCoV是感染人类的冠状病毒家族中的第7个成员。正在对其加强监测和进一步调查。(由国家重点研究开发项目、国家传染病防治重点项目资助)

新出现和重新出现的病原体是对公共卫生的全球性挑战。冠状病毒是一种包膜RNA病毒,广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中,可引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。已知有六种冠状病毒会引起人类疾病。四种病毒- 229E、OC43、NL63和HKU1 -在具有免疫能力的个体中普遍存在并通常引起普通感冒症状。另外两种毒株——严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)——最初是人畜共患的,有时与致命疾病有关。SARS-CoV是2002年和2003年广东省暴发严重急性呼吸道综合征疫情的病原体。MERS-CoV是2012年中东爆发严重呼吸系统疾病的病原体。鉴于冠状病毒的高度流行和广泛分布,其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组,以及人-动物界面活性的增加,由于频繁的跨物种感染和偶尔的溢出事件,新的冠状病毒可能在人类中周期性地出现。

在2019年12月下旬,几家地方卫生机构报告了与中国湖北省武汉市一家海鲜和湿性动物批发市场有关的不明原因肺炎患者群集。2019年12月31日,中国疾病预防控制中心(中国疾病预防控制中心)派出快速反应小组,陪同湖北省和武汉市卫生当局进行流行病学和病原学调查。我们报告了这次调查的结果,确定了肺炎群集的来源,并描述了在肺炎患者中检测到的一种新型冠状病毒,这些患者的标本在疫情早期由中国疾病预防控制中心进行了检测。我们还描述了其中两例肺炎的临床特征。

【研究方法

病毒的诊断方法

收集了4例下呼吸道样本,包括支气管肺泡灌洗液,均来自于2019年12月21日或之后在武汉确诊的不明原因肺炎患者,这些患者在接近临床表现临近时曾在华南海鲜市场出现过。收集7例北京医院已知原因肺炎患者的支气管肺泡灌洗液标本作为对照。按照制造商(Roche)的描述,从临床样本(包括作为阴性对照的未受感染的培养物)中提取核酸需要使用高纯病毒核酸试剂盒。提取的核酸样本按照制造商说明,使用RespiFinderSmart22kit (PathoFinder BV)和LightCycler 480 real-time PCR系统,通过聚合酶链反应(PCR)检测病毒和细菌。样本分析了22种病原体(18种病毒和4种细菌),详见附录。此外,先前描述的无偏倚、高通量测序被用来发现无法通过上述方法识别的微生物序列。实时逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)检测用于检测病毒RNA锅β-CoV RdRp地区通过目标共识,如补充附录所述。

病毒分离/筛分离法

隔离的病毒收集支气管肺泡灌洗液样本,置于无菌杯中,加入病毒载体。然后离心样品以去除细胞碎片。上清接种在人气道上皮细胞上,人气道上皮细胞是从肺癌患者手术切除的气道标本上获得的,经NGS证实为无特定病原体。

将人气道上皮细胞扩张到塑料基质上,生成传代-1细胞,然后在可渗透的Transwell-COL(直径12毫米)支架上以每孔2.5 105个细胞的密度镀覆。将人气道上皮细胞培养在空气-液体界面中培养4 - 6周,形成分化良好的极化培养物,类似于体内假层状黏液上皮。

感染前,用磷酸盐缓冲盐水冲洗人气道上皮细胞顶面三次;支气管肺泡灌洗液样品上清液150μl接种于细胞培养物的顶面。在37℃孵育2小时后,用500μl磷酸盐缓冲盐水冲洗10分钟,将人呼吸道上皮细胞维持在37℃、5%二氧化碳的空气-液体界面中。每隔48小时,将150μl磷酸盐缓冲液涂在人气道上皮细胞的顶端表面,在37℃下孵育10分钟后采集样本。假层状粘液上皮细胞在此环境中得以维持;根尖标本以1:3稀释的瓶状液传代至新细胞。每天用光镜观察细胞病变,用RT-PCR检测上清液中是否存在病毒核酸。三次传代后,制备根尖标本和人气道上皮细胞进行透射电镜观察。

透射电子显微镜法

收集具有细胞病变作用的人气道上皮细胞培养物上清液,用2%多聚甲醛灭活至少2小时,超速离心使病毒颗粒沉淀。浓缩上清液在覆膜网格上呈阴性染色进行检测。收集具有细胞病变作用的人气道上皮细胞,用2%对甲醛- 2.5%戊二醛固定,用1%四氧化锇脱水,用级乙醇包埋PON812树脂固定。切片(80 nm)从树脂块上切下,分别用乙酸铀酰和柠檬酸铅(醋酸铀和柠檬酸铅)染色。透射电镜下观察阴性染色网格和超薄切片。

病毒基因组测序

以支气管肺泡灌洗液和培养上清液中提取的RNA为模板进行基因组克隆和测序。我们使用Illumina测序和nanopore测序相结合的方法来描述病毒基因组。使用CLC Genomics软件version 4.6.1 (CLC Bio)将序列序列序列组装成contig图谱(一组重叠的DNA片段)。随后设计特异性引物进行PCR,并使用5′- 或者3′- 小种 (cDNA末端快速扩增)填补常规Sanger测序的基因组空白。这些PCR产物从凝胶中纯化,按照制造商的说明,使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒和3130XL基因分析仪进行测序。利用肌肉对2019-nCoV和参考序列进行多序列比对。利用RAxML(13)进行全基因组的系统发育分析,共进行了1000次自举复制,并建立了一个通用的时间可逆模型作为核苷酸替代模型。

【结论

患者

2019年12月27日,武汉一家医院收治3名成人重症肺炎患者。患者1为49岁女性,患者2为61岁男性,患者3为32岁男性。临床资料可用于患者1和2。患者1报告没有潜在的慢性疾病,但于2019年12月23日出现发烧(温度,37°C至38°C)和咳嗽伴有胸部不适。发病4天后,她的咳嗽和胸部不适加重,但发烧减轻;肺炎的诊断是基于计算机断层扫描。她的职业是海鲜批发市场的零售商。患者2最初于2019年12月20日报告发烧和咳嗽;发病7天后出现呼吸窘迫,并在接下来的2天内恶化(见胸片,图1),此时开始机械通气。他是海鲜批发市场的常客。患者1和3于2020年1月16日康复出院。患者2于2020年1月9日死亡。未获得活检标本。

一种新型冠状病毒的检测与分离

2019年12月30日于武汉金银潭医院采集3例支气管肺泡灌洗标本。用RespifinderSmart22试剂盒在这些患者的临床标本中未检测到特定病原体(包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)。以从患者支气管肺泡灌洗液中提取的RNA为模板,采用Illumina测序和纳米孔测序相结合的方法克隆和测序基因组。从单个样本中获得20000多个病毒片段,并且大多数叠连群与来自betacoronavirus属B系的基因组匹配-显示出与之前公布的蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45,MG772933.1)基因组呈现85%以上的一致性。用实时RT-PCR检测RNA靶向panβ-CoV的RdRp区(尽管检测样品的循环阈值高于34),也获得了阳性结果。用人气道上皮细胞和Vero E6、Huh-7细胞株进行病毒分离。分离出的病毒名为2019- nCoV。

为了确定病毒颗粒是否能在2019年nCoV感染的人气道上皮细胞中看到,在接种后6天,每天用光学显微镜和透射电镜检查模拟感染和2019年nCoV感染的人气道上皮细胞培养物。接种后96小时观察到人气道上皮细胞表面层的细胞病变作用;病灶中心光镜下可见纤毛搏动缺失(图2)。接种后6d,Vero E6和Huh-7细胞系未观察到特异性细胞病变。

负染色的2019个nCoV粒子的电子显微照片通常是球形的,具有一些多形性(图3)。直径从60到140纳米不等。病毒粒子有非常独特的尖峰,约9至12纳米,使病毒粒子看起来像日冕。在人气道上皮超薄切片可见胞外游离病毒颗粒和胞质膜结合小泡内充满病毒颗粒的包涵体。观察到的形态与冠状病毒科一致。

为进一步鉴定该病毒,通过Illumina和nanopore测序,从临床标本(支气管肺泡灌洗液)和人气道上皮细胞病毒分离株中获得2019个nCoV基因组的从头序列。新的冠状病毒是从三个病人身上鉴定出来的。从支气管肺泡灌洗液(BetaCoV/huanzhou/IVDC-HB-04/2020,BetaCoV/huanzhou/IVDC-HB-05/2020,EPI-ISL-u402121)中获得两个近全长的冠状病毒序列,并从从患者分离的病毒(BetaCoV/huanzhou/IVDC-HB-01/2020,EPI-ISL-u402119)中获得一个全长序列。

将三种新型冠状病毒的全基因组序列提交给GISAID(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019,加入ID:EPI_ISL_402119;BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020,加入ID:EPI_ISL_402120;BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019,加入编号:EPI_ISL_402121),与先前发表的蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45,MG772933.1)基因组具有86.9%的核苷酸序列同源性。这三个2019-nCoV基因组聚集在sarbecev亚属内,表现出典型的倍锥病毒组织:5个未翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3个UTR,以及几个未识别的非结构开放阅读框。

尽管2019-nCoV与蝙蝠体内检测到的一些β-回旋病毒相似(图4),但它与SARS-CoV和MERS-CoV不同。来自武汉的3株2019-nCoV冠状病毒与两株蝙蝠源SARS样株ZC45和ZXC21形成了一个明显的分支。来自人类的SARS-CoV株和来自中国西南部蝙蝠的遗传相似的SARS样冠状病毒在sarbecovirus亚属内形成了另一个分支。由于2019-nCoV与betacoronavirus其他成员在保守复制酶结构域(ORF 1ab)中的序列同源性小于90%,因此2019年nCoV是武汉地区病毒性肺炎的可能致病因子,是冠状病毒科sarbecvirus亚属的新型倍他冠状病毒。

【讨论

我们报告了一种新的CoV(2019- nCoV),于2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中发现。该病毒存在的证据包括通过全基因组测序、直接PCR和培养在三名患者的支气管肺泡灌洗液中鉴定。这种可能由这种冠状病毒引起的疾病被称为“新型冠状病毒感染性肺炎”(NCIP)。完整的基因组被提交给GISAID。系统发育分析显示,2019-nCoV属于betacornavirus属,包括在人类、蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒(SARS-CoV、蝙蝠类SARS-CoV等)。我们报道了病毒的分离及其特异性细胞病变效应和形态学的初步描述。

多年来,分子技术已成功地用于传染源的鉴定。无偏见、高通量测序是发现病原体的有力工具。下一代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病爆发的方式,提高我们对疾病发生和传播的认识,加快病原体的鉴定,促进数据共享。我们在本报告中描述了利用分子技术和无偏DNA测序发现一种新的β-轮状病毒,该病毒可能是中国武汉三名患者重症肺炎的病因。

虽然建立人气道上皮细胞培养是劳动密集型的,但它们似乎是分析人呼吸道病原体的一个有价值的研究工具我们的研究表明,呼吸道分泌物最初在人气道上皮细胞培养物上增殖,然后用透射电子显微镜和培养上清的全基因组测序成功地用于观察和检测新的人冠状病毒,这可能是传统方法无法识别的。

进一步发展准确、快速的方法来识别未知的呼吸道病原体仍然是需要的。在分析本研究获得的3个完整基因组的基础上,我们设计了几种针对2019-nCoV基因组ORF1ab、N和E区域的特异性和敏感性分析,以检测临床标本中的病毒RNA。这些引物和标准操作程序已与世界卫生组织共享,用于在全球和中国监测和检测2019-nCoV感染。最近的数据显示,2019年,中国有830人检测出ncov。

尽管我们的研究不符合科赫的假设,但我们的分析提供了证据,表明2019-nCoV与武汉疫情有关。证实武汉疫情中2019-nCoV的病原学意义的其他证据包括通过免疫组化分析在患者肺组织中鉴定2019-nCoV抗原,在两个时间点检测患者血清样本中的IgM和IgG抗病毒抗体以证明血清转化,以及动物(猴子)实验来提供致病性的证据。至关重要的是进行流行病学调查,以确定感染导致的传播模式、繁殖间隔和临床谱,从而为制定预防、控制和制止2019-nCoV传播的战略提供信息和改进。

这项工作得到了国家重点研究开发项目(2016YFD0500101)和国家传染病防治重大项目(2018ZX1001002)的资助。

作者提供的公开表格可以在NEJM.org上获得本文的全文。

朱博士、张博士、王博士、李博士和杨博士对本文的贡献是一样的。

本文于2020年1月24日发表,并于2020年1月29日在NEJM.org上更新。

我们感谢李中杰博士、何广学博士、兰斯·罗德瓦尔德博士、于力博士、费叶博士、李昭博士、周伟民博士、刘军博士、姚蒙博士、王慧娟博士以及中国疾控中心的许多工作人员,感谢他们在编写和提交早期版本的手稿方面所作的贡献和帮助。

【第一作者单位

中国疾病预防控制中心国家病毒性疾病预防控制所生物安全重点实验室,

北京首都医科大学地坛医院传染病科;

湖北省疾病预防控制中心(B.Y, F.Z.)、

中国科学院生物安全特大型科学中心(W.T.)、

湖北省疾病预防控制中心(B.Y., F.Z.)、武汉市金银滩医院(D.Z.);

山东第一医科大学和山东医学科学院,山东济南(W.S.)。

中国疾病预防控制中心国家病毒性疾病预防控制所生物安全重点实验室,谭博士,高博士,吴博士

网易号外|出品人:姚长盛 齐栋梁

本文作者|王冠苏(上海) 

 主编|戴鹭 

爆料邮箱:money@service.netease.com

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