Nat Biotechnol | 周英思/杨辉/谭国鹤/黄锦海等合作:smCRISPRa——基于紧凑型Cas12m的单AAV体内多重基因激活平台

如果一种疾病的根源不是基因“出错”，而是基因“不够”，能否不改写DNA，只把内源基因的表达“调上去”？如果某个关键蛋白先天缺失，能否唤醒一个功能相近的“替补队员”？更进一步，能否只用一个病毒载体，同时上调多个基因？

CRISPR转录激活技术（CRISPRa）为这些问题提供了一条不依赖DNA切割的路径：借助可编程的DNA定位能力，将转录激活模块招募至目标基因的调控区域，从而提高内源基因的表达水平。然而，要将这一策略推向体内多靶点调控并不容易。一方面，单条引导RNA的激活效果受靶位点和染色质环境影响，往往需要多位点协同才能达到足够的表达水平；另一方面，复杂疾病的治疗可能需要同时调节多个基因，而Cas蛋白、激活模块与多条引导RNA组成的表达系统，又容易超出腺相关病毒（AAV）有限的包装容量。如何兼顾小尺寸、强激活与多靶点能力，是体内CRISPRa技术走向应用必须回答的问题。

2026年10月28日，中国科学院上海药物研究所和中山药物创新研究院杨辉/周英思/李国玲团队、广西医科大学谭国鹤团队以及复旦大学附属眼耳鼻喉科医院黄锦海团队等多家国内单位合作，在Nature Biotechnology杂志发表题为An engineered, compact Cas12m variant for multiplexed gene activation in vivo 的研究论文。研究团队通过蛋白质与RNA的协同工程化改造，开发出紧凑型转录调控工具denCas12m，并在此基础上构建smCRISPRa平台，实现了单个AAV载体递送的体内多位点、多基因激活，在Dravet综合征和杜氏肌营养不良症（DMD）小鼠模型中均获得显著的功能改善。

紧凑且会“自我加工”的Cas12m

这项工作的起点，是一类兼具紧凑结构与RNA自主加工能力的Cas12m蛋白。Cas12m家族蛋白仅由约600个氨基酸组成，能够识别较为宽松的TTN核心PAM，并可自行加工前体crRNA。这意味着，多条引导RNA可以串联在同一转录单元中，进入细胞后再被加工为具有功能的独立crRNA，从而大幅节省多靶点表达所需的载体空间。

研究团队从基因组和宏基因组数据中鉴定出18个未经表征的Cas12m同源蛋白，在哺乳动物细胞中系统评价后，选定不具DNA切割活性、但保留前体crRNA加工和可编程转录激活能力的Cas12m18作为改造基础。针对其野生型激活效率有限的问题，团队通过多轮精氨酸扫描、突变体组合筛选及crRNA直接重复序列优化，构建denCas12m系统，并与增强型转录激活模块enminiVPR融合，形成最终的smCRISPRa平台。

紧凑与自我加工的特性在这一平台中得到充分发挥：一组crRNA既可同时靶向同一基因的多个调控位点，也可分别靶向不同基因，实现多基因表达调控；其兼容的全部16种NTTN PAM组合，也为有限的启动子区域提供了更多候选靶位点。与dhyperCas12a、dCasMINI及dSpCas9相比，denCas12m系统在活性、尺寸和多基因调控能力上展现出综合优势。

弥补补偿剂量不足：单AAV挽救Dravet小鼠

技术能否真正发挥作用，需要在疾病模型中检验。研究团队首先将smCRISPRa应用于Scn1a单倍剂量不足的Dravet综合征小鼠模型。Scn1a编码电压门控钠通道NaV1.1，提高其内源表达是补偿基因剂量不足的一条直接路径。研究者将靶向Scn1a的双crRNA阵列与激活系统共同装入单个AAV9载体，并对新生小鼠进行侧脑室注射。结果显示，治疗组小鼠皮层中的Scn1a转录本和NaV1.1蛋白水平显著升高。更重要的是，在约100天的观察期内，两个治疗剂量组均保持100%存活，与野生型小鼠相当；治疗还显著提高了小鼠的热诱导癫痫发作阈值，并减少了异常脑电活动和癫痫发作频率。这些结果表明，单AAV递送的内源基因激活可有效弥补该模型中的基因剂量不足，并转化为生存和神经功能层面的获益。

激活补偿性基因：utrophin带来持久获益

在DMD模型中，研究团队进一步验证了激活补偿性基因的策略。杜氏肌营养不良症（DMD）由抗肌萎缩蛋白dystrophin功能缺失引起：其编码序列是人体最大的基因之一，巨大的尺寸让传统递送系统无从下手，高度分散的突变谱又让单一修复方案难以覆盖广泛患者人群。Utrophin是与dystrophin在蛋白质结构和功能上高度同源的胞膜支架蛋白，已有研究表明激活utrophin表达可持久改善DMD小鼠的运动功能。基于此，研究团队围绕Utrn设计多位点crRNA阵列，在两种人源化DMD小鼠模型中均观察到utrophin表达增加，且在头对头比较中优于已报道的dCasMINI-VPR载体。随后，团队经静脉给予靶向Utrn基因的AAV9-smCRISPRa-U2载体，开展系统性治疗评估：小鼠胫骨前肌、心脏和膈肌中的utrophin表达升高，前肢握力、转棒表现及肌肉抗疲劳能力均显著改善；给药6个月后，相关组织仍维持较高的Utrn表达，握力和转棒表现的改善也持续存在，支持该策略在所测试模型中的长期功能获益。转录组分析进一步显示，治疗未引起明显的脱靶基因表达变化，提示该系统具有较好的特异性。

值得一提的是，这一激活策略与团队近期发表于Cell的DMD体内基因编辑研究形成了呼应与互补。在该项研究中，团队以单个AAV载体递送小型高保真核酸酶hfCas12Max，靶向DMD基因51号外显子的剪接位点，完成了从人源化小鼠、食蟹猴到首次人体研究的完整转化，并首次在人体骨骼肌中获得了CRISPR体内编辑的直接分子证据（详见BioArt报道：）。不过，此类外显子特异性修复策略仅适用于携带相应突变的患者亚群；相比之下，激活内源utrophin不依赖患者的具体突变类型，理论上可覆盖全部DMD患者，包括难以适用外显子跳跃策略的人群，有望与位点特异性基因编辑形成互补。

从单基因走向多基因组合

从单基因增强走向多基因组合，是smCRISPRa的重要应用方向。研究团队将支持肌膜稳定性的Utrn与参与肌肉生长调节的Fst装入同一个AAV载体，实现了两种内源基因的联合激活。在DMD小鼠中，该组合在维持Utrn激活能力的同时提高了Fst表达，小鼠的功能表现也获得进一步改善。系统的扩展能力同样得到验证：研究团队在小鼠海马和骨骼肌中共同激活了Oct4、Sox2和Klf4三个内源转录因子；更进一步，单个AAV载体可容纳包含8条crRNA的阵列，同时提高Scn1a、Utrn、Fst、Sox2、Oct4和Klf4六个基因的表达，展示了紧凑型系统支持较高阶体内多基因调控的能力。需要说明的是，OSK相关实验验证的是内源基因的共同激活，尚不能据此认定已经实现细胞重编程或组织年轻化。此外，该系统在人原代T细胞中验证了HBE1、CARD9和MYOD1的多基因激活；将denCas12m与KRAB抑制结构域融合后，亦可实现靶向转录抑制，显示出跨细胞类型和调控模式的适用性。

综上所述，这项研究将紧凑型效应蛋白、较宽的靶位点兼容性、自主加工crRNA阵列和增强型激活模块整合于同一平台——smCRISPRa，把单AAV递送与体内多基因调控衔接起来。两类疾病模型分别验证了提高剂量不足基因表达和激活补偿性基因的可行性，多基因实验则进一步拓展了组合调控的空间。未来，围绕组织特异性、激活幅度与持续时间、长期安全性以及重复序列阵列的稳定性开展优化，将有助于进一步评估其应用潜力。尤其在DMD这类突变高度异质的疾病中，不依赖突变类型的内源基因激活策略有望覆盖更广泛的患者人群，是未来值得重点关注的发展方向。

中国科学院上海药物研究所/中山药物创新研究院张海南、杨琳、韩鼎毅、李英男，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院刘玉玲，福建医科大学林佳佳为论文共同第一作者；中国科学院上海药物研究所李国玲、周英思、杨辉和张海南，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院黄锦海，以及广西医科大学谭国鹤担任共同通讯作者。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-026-03352-5

制版人： 十一

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