浙江
提前终止密码子约占人类遗传病致病变异的11%，相关疾病分散在数千种罕见病中，现有抑制tRNA疗法在组织覆盖、氨基酸替换耐受性和蛋白类型验证上仍不充分。近日，浙江大学林世贤团队与丁文龙团队合作完成了题为《Alanine-based suppressor tRNA enables disease-agnostic nonsense suppression across protein classes and inheritance patterns》的研究，并开发了ALPHA平台。该平台把丙氨酸抑制tRNA与AAV9递送结合起来，在多种提前终止密码子致病模型中恢复全长蛋白表达。
研究团队先整合ClinVar中66,876个致病PTC变异与Orphadata罕见病注释，得到3,424种相关罕见病，常染色体显性、常染色体隐性和X连锁隐性合计覆盖85.7%。他们用AlphaMissense逐一评估PTC位点替换为其他19种氨基酸的预测后果，丙氨酸替换的良性比例最高、致病比例最低，66,070个可评分变异中有30,515个预测为良性。GTEx和小鼠组织蛋白组数据还显示，丙氨酰tRNA合成酶在多种组织中表达高且分布均匀，为选择丙氨酸和评估小鼠模型提供了依据。
在tRNA工程上，团队把tRNAAla的G3:U70身份元件移植到正交chPheT支架，并共表达PyIRS的tRNA结合结构域TD104，使TAG通读效率从36.3%提高到55.4%。他们对tRNA主体做模块化改造并筛选104个变体，最优变体把报告基因表达恢复到野生型EGFP的78.5%，对TGA和TAA的通读分别为51.3%和18.4%，LC-MS检测显示PTC位点丙氨酸插入保真度接近100%。AAV盒采用4拷贝tRNA、U6与H1交替启动子和CB6驱动的FLAG-TD104，最终选出的ALPHA-6在体内报告小鼠中信号最高且维持较久。
在MPS I的Idua W392TAG小鼠中，单次静脉注射ALPHA-6使血清IDUA活性恢复到野生型的13.1%，尿GAG下降并维持16周，步态和颧弓厚度改善，心脏与肝脏IDUA活性分别恢复到7.4%和2.6%，LAMP1升高被削弱。DMD的Dmd Q995TAG小鼠接受全身给药后，骨骼肌、心脏和膈肌出现全长抗肌萎缩蛋白，肌肉结构、肌膜蛋白定位、血清CK、握力、转棒和跑台耐力均有改善。Alport综合征的Col4a5 R471TAG小鼠尿白蛋白/肌酐比值进展减慢，BUN和肌酐降低，肾小球病变与纤维化减轻，COL4A5免疫荧光恢复。FAP的Apc L850TAG小鼠肠道肿瘤数量和负荷下降，贫血与脾肿大缓解，β-catenin免疫组化显示异常Wnt信号趋于正常，大鼠高剂量4周和MPS I小鼠16周观察未出现明显毒性。
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