Vita | 林世贤/丁文龙团队开发嵌合翻译系统实现跨遗传模式、靶器官与蛋白类型的无义突变通读

提前终止密码子（premature termination codon，PTC）约占人类遗传病致病变异的11%。这类突变会在蛋白质编码序列中引入终止信号，导致翻译提前终止，并可能触发无义介导的mRNA降解，最终造成全长功能蛋白缺失。PTC广泛分布于数千种遗传性疾病。尽管这些疾病涉及不同基因、组织器官和遗传模式，它们共享相同的分子缺陷——核糖体在蛋白质合成完成前过早停止。因此，针对PTC本身而非单一疾病或单一基因开发治疗策略，有望为高度异质的遗传病提供更加通用的解决方案。

工程化抑制型tRNA（suppressor tRNA，sup-tRNA）为此提供了一种可能。通过重新识别PTC并在相应位置插入氨基酸，sup-tRNA可以使核糖体继续翻译，恢复全长蛋白表达，而无须直接编辑基因组。近年来，多项研究已经证明sup-tRNA可以在细胞和动物模型中恢复蛋白表达。然而，其广泛应用仍面临几个关键问题：不同氨基酸在致病突变位点的替换耐受性差异显著；对应氨酰-tRNA合成酶的组织表达可能影响sup-tRNA活性；现有体内验证主要集中于有限的蛋白类型和疾病模型；sup-tRNA能否用于需要精确控制蛋白表达量的显性遗传病，也尚未得到充分验证。

浙江大学林世贤/丁文龙团队长期从事遗传密码扩展与正交翻译系统研究。此前，团队发展了嵌合设计策略，构建了多种在原核和真核生物中均具有较高活性和正交性的嵌合翻译系统。基于这些系统，团队实现了数十种结构各异的非天然氨基酸的高效遗传编码，并应用于模拟脂肪酸修饰、引入色氨酸衍生物调控阳离子-π相互作用、开发荧光探针、研究翻译后修饰功能以及鉴定新型蛋白质修饰等方向（；；）。这些嵌合tRNA骨架对反密码子改造具有较好的耐受性，也为重新设计氨基酸识别特征提供了工程基础。在此基础上，团队进一步将嵌合翻译系统应用于无义突变的通读治疗。

2026年10月27日，浙江大学林世贤/丁文龙在Vita发表题为Alanine-based suppressor tRNA enables disease-agnostic nonsense suppression across protein classes and inheritance patterns的研究论文。研究结合人类遗传变异分析、tRNA工程化和体内基因递送，开发了丙氨酸抑制型tRNA平台ALPHA。通过AAV9递送的ALPHA能够在三种不同遗传模式、四种PTC疾病小鼠模型和五种不同患病器官中恢复全长蛋白表达，覆盖可溶性酶、超大型细胞骨架蛋白、分泌型细胞外基质蛋白和剂量敏感型信号调节蛋白，并改善相应疾病表型。

从人类致病变异图谱中选择用于PTC读通的候选氨基酸

sup-tRNA在PTC位置插入哪一种氨基酸，是决定恢复后全长蛋白能否正常工作的关键因素。对于具有广泛适用性的sup-tRNA平台，理想的修复氨基酸既应在大量PTC位点具有较高的替换耐受性，其对应的氨酰-tRNA合成酶也应在不同组织中广泛表达。

研究团队首先结合ClinVar数据库中的致病性PTC变异和AlphaMissense模型，评估在这些位点分别插入不同氨基酸可能产生的影响。结果显示，丙氨酸替换具有最高的预测良性比例和最低的预测致病比例。这些预测可耐受的替换分布于TAG、TGA和TAA三类PTC之中。与此同时，基于GTEx数据的分析显示，人源丙氨酰-tRNA合成酶AlaRS在不同组织中具有较高且相对均一的表达。小鼠组织蛋白质组数据也支持AlaRS的广泛可用性。

综合氨基酸替换耐受性和氨酰-tRNA合成酶的组织可用性，研究团队选择丙氨酸作为构建广谱sup-tRNA平台的候选修复氨基酸。

正交骨架工程获得高活性丙氨酸sup-tRNA

确定用于PTC读通的氨基酸后，研究团队开始构建能够高效识别PTC的丙氨酸sup-tRNA。丙氨酸tRNA受体茎中的G3:U70碱基对，是AlaRS识别并装载丙氨酸的重要身份元件。然而，直接改变人源丙氨酸tRNA的反密码子，或者将G3:U70元件移植到其他人类tRNA骨架中，均未产生足够活性的丙氨酸sup-tRNA。这说明AlaRS对tRNA的识别不仅取决于单一身份元件，也受到tRNA整体结构的影响。

研究团队由此将目光转向遗传密码扩展领域使用的正交tRNA骨架。这些骨架此前已被证明能够容纳反密码子改变，同时对内源翻译系统的干扰较小。研究人员将G3:U70丙氨酸身份元件引入一组正交tRNA骨架，并利用双荧光报告系统检测其TAG通读活性。初步筛选获得了一种具有活性的嵌合tRNA。为进一步提高通读效率，团队将tRNA划分为受体茎、反密码子茎、D臂和T臂四个结构模块，将可能增强活性的结构元件分别引入这些模块，再进行多轮组合优化，最终获得多种高活性候选分子。其中表现最好的变体在TAG条件下可恢复至较高水平的报告蛋白表达，且质谱分析确认丙氨酸插入的保真度接近100%。研究团队将这一平台命名为ALPHA，即Alanine-based Programmable tRNA for Haploinsufficiency and PTC-Associated diseases。

AAV9递送ALPHA实现持续体内通读

在细胞实验基础上，研究团队进一步优化了用于体内递送的AAV表达系统，并将高活性丙氨酸sup-tRNA与PylRS的tRNA结合结构域TD104装载于同一载体中。研究人员首先在携带TAG提前终止密码子的Rosa26荧光素酶报告小鼠中比较不同ALPHA表达盒。ALPHA-6产生了较强且持续的体内通读信号，因此被用于后续疾病模型研究。

为检验同一ALPHA平台能否跨越不同蛋白类型、靶器官和遗传模式，研究团队选择了四种PTC疾病小鼠模型：

• MPS I模型，靶蛋白IDUA为可溶性溶酶体酶，代表常染色体隐性遗传病；

• DMD模型，靶蛋白dystrophin为超大型细胞骨架蛋白，代表X连锁隐性遗传病；

• Alport综合征模型，靶蛋白COL4A5为需要分泌和胞外组装的基质蛋白，代表X连锁隐形遗传病；

• FAP模型，靶蛋白APC为剂量敏感型信号调节因子，代表常染色体显性遗传病。

在黏多糖贮积症I型模型中，ALPHA恢复了IDUA酶活性并降低糖胺聚糖负荷，改善步态和骨骼异常；在杜氏肌营养不良症模型中，恢复了全长抗肌萎缩蛋白表达，并改善肌肉组织结构和运动功能；在X连锁Alport综合征模型中，恢复了COL4A5表达，减缓了蛋白尿进展并减轻肾脏病理改变；在家族性腺瘤性息肉病模型中，减少了肠道肿瘤负荷并改善了相关全身表现。这四种模型并不是对ALPHA通读活性的重复验证，而是分别检验ALPHA能否恢复酶活性、支持超大型蛋白完整合成、恢复分泌型蛋白的胞外组装，以及在内源调控环境中恢复剂量敏感型蛋白。

图1 ALPHA平台的设计原理及其在四种无义突变小鼠模型中的应用示意图

初步体内安全性评价

研究团队还在野生型大鼠中评价了高剂量rAAV9.ALPHA-6的耐受性。在4周观察期间，治疗组雌雄大鼠的体重变化和摄食量与对照组相近，血清IgG未见升高。对脑、心、肺、肝、脾、肾及生殖器官进行组织学检查，未发现明显的治疗相关结构异常、炎症浸润或细胞毒性。接受高剂量ALPHA-6的MPS I小鼠在16周终点也未见明显治疗相关组织病理异常。这些结果为ALPHA平台的进一步研究提供了初步安全性支持。

总结

本研究从人类致病性PTC变异图谱出发，将氨基酸替换耐受性与氨酰-tRNA合成酶的组织表达相结合，选择丙氨酸作为候选修复氨基酸。通过将丙氨酸身份元件移植至前期开发的正交嵌合tRNA骨架，并开展模块化结构优化，研究团队建立了具有高通读效率和插入保真度的ALPHA平台。

在四种小鼠模型中，ALPHA恢复了可溶性溶酶体酶、超大型细胞骨架蛋白、分泌型细胞外基质蛋白和剂量敏感型信号调节蛋白的表达，并改善相应的生化、组织学和功能指标。这项研究的核心价值并非仅证明一种sup-tRNA可以作用于四种具体疾病，而是说明同一翻译校正策略能够跨越不同蛋白结构、靶器官和遗传模式。ALPHA由此为按照共同突变机制而非单一疾病名称划定治疗范围，提供了体内概念验证。同时，这一工作也展示了团队前期嵌合翻译系统在疾病治疗场景中的进一步应用。

博士生方成竹、魏雷庭是论文的共同第一作者，林世贤教授和丁文龙研究员是本文的通讯作者。研究工作得到了冯新华教授的大力帮助。

浙江大学林世贤实验室聚焦于中心法则的翻译过程，整合交叉学科的研究手段，探索tRNA和蛋白质修饰的生物学功能和工程改造，并致力于开发新型生物医药，用于重大代谢疾病和罕见遗传病的诊疗。因为课题发展的需要，目前正在招募科研人员，欢迎感兴趣的博士后和研究生联系并申请加入。实验室链接：

http://lsi.zju.edu.cn/25713/list.htm

浙江大学丁文龙实验室以化学生物学和遗传密码工程为特色，致力于开发新型的生物技术和分子工具，拓展生命体系的研究和调控能力。围绕肿瘤等重大疾病，开展疾病机制研究和创新药物研发。个人主页：

https://person.zju.edu.cn/0024151

https://www.vita-journal.com/vita/EN/10.15302/vita.2026.10.0079

制版人： 十一

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