Science丨噬菌体蛋白酶是CBASS抗噬菌体免疫的触发因素

撰文丨章台柳

动物、植物和细菌各自合成专门的核苷酸信号，以应对病毒感染并启动抗病毒防御。在动物中，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）样受体通过识别病毒DNA或RNA来感知感染，并合成环二核苷酸信号以激活受体STING。细菌编码一条进化上相关的通路，名为CBASS（基于环状寡核苷酸的抗噬菌体信号系统），其中与人类cGAS在祖先上相关的cGAS/DncV样核苷酸转移酶（CD-NTase）感知噬菌体感染，并合成环二核苷酸和环三核苷酸信号，以激活下游效应蛋白和抗病毒防御。仅由一个CD-NTase和一个效应蛋白组成的CBASS操纵子被指定为I型操纵子，是CBASS最常见的形式。其他CBASS操纵子（II至IV型）编码额外的CD-NTase相关蛋白（Cap），这些蛋白调控CD-NTase的激活，但目前对调控机制了解较少。CBASS免疫的激活会引发顿挫感染（abortive infection），即细菌进入休眠或死亡，以限制噬菌体复制并防止病毒传播至邻近细胞。由于这种适应度代价巨大，CBASS仅在噬菌体复制周期的晚期被激活，并作为抗病毒防御的最后一道防线发挥作用。同时，近期研究已在噬菌体基因中鉴定出抗CBASS的逃逸突变，包括主要衣壳蛋白、支架蛋白以及与病毒粒子形成最后步骤相关的晚期病毒非编码RNA，但大多数CD-NTase酶所识别的具体分子因子仍不清楚。

近日，来自哈佛医学院的Samuel J. Hobbs和Philip J. Kranzusch合作在Science杂志上发表文章Phage proteases activate CBASS antiphage immunity，揭示了噬菌体前头蛋白酶活性作为一种广泛存在的CD-NTase激活机制。在体外重构了CBASS对噬菌体T4的识别，并鉴定出CD-NTase激活环的蛋白水解切割是免疫信号的触发因素。噬菌体前头蛋白酶在体内直接激活CBASS，从而解释了免疫如何在感染后期被启动。基于结构的系统发育分析鉴定了进化枝A、D和GCD-NTase中的激活环，并确定了控制识别不同噬菌体家族的残基。研究确立了CBASS对噬菌体蛋白酶活性的识别是一种广泛存在的抗病毒防御机制。

为了确定CBASS抗噬菌体防御所感知的因子，研究人员利用模型病毒——大肠杆菌噬菌体T4在体外生化重构病毒诱导CD-NTase激活这一关键步骤。噬菌体T4及其他Tevenvirinae家族噬菌体编码一组抗CBASS（Acb）蛋白，专门用于破坏控制CBASS抗噬菌体防御的宿主核苷酸信号。一个缺少功能性acb1和acb2的工程化噬菌体T4变体（T4 Δacb1/Δacb2）会受到大肠杆菌II型CBASS操纵子的限制，这表明Acb蛋白对于掩盖噬菌体T4中激活CBASS的未知因子的效应是必需的。对大肠杆菌CD-NTase CdnG（EcCdnG）、调控蛋白Cap2/Cap3以及DNase效应蛋白EcCap5的失活突变均能恢复噬菌体复制，支持噬菌体T4 Δacb1/Δacb2的限制是通过经典的CD-NTase激活和下游CBASS信号传导发生的。制备感染噬菌体T4 Δacb1/Δacb2的细胞的可溶性裂解物，并将该样本与单独制备的表达CBASS效应蛋白失活变体（EcCap5 H56A）的细胞裂解物混合，分析重构反应中CD-NTase激活情况。结果显示，CD-NTase激活仅存在于感染噬菌体T4 Δacb1/Δacb2的细胞裂解物中，而不存在于未感染细胞的裂解物中。测试噬菌体T4 Δacb1/Δacb2感染的时间进程，在感染后14分钟或更晚制备的所有裂解物中观察到CD-NTase激活。这些结果表明，CBASS激活特异性地响应于噬菌体T4感染晚期产生的一种可溶性因子。感染晚期主要涉及新病毒粒子的形成，T4病毒粒子的形成是一个严格调控的过程，其中衣壳亚基围绕蛋白质支架组装，形成称为前头（prohead）的结构，随后由噬菌体编码的前头蛋白酶gp21加工，形成能够进行基因组包装的成熟衣壳。使用基因组片段方法筛选晚期表达的噬菌体T4基因，发现病毒前头蛋白酶蛋白gp21是唯一足以在体内触发CBASS依赖性毒性的基因。进一步研究发现CBASS的激活可能是响应蛋白水解活性而发生的，不仅仅是与特定病毒因子形成复合物。且在多种噬菌体中都验证了，前头蛋白酶直接切割CD-NTase酶，并足以在体内触发CBASS免疫信号传导。

为了确定外源蛋白酶如何诱导CD-NTase激活，研究人员在体外监测3′2′-cGAMP合成激活过程中EcCdnG蛋白的稳定性。在胰蛋白酶存在下，EcCdnG 3′2′-cGAMP合成的激活与EcCdnG被切割成约28-kDa蛋白片段同时发生。结构分析显示，经典CD-NTase双叶酶结构中心的约30个氨基酸处鉴定出一个表面暴露的无序环，其切割将产生约28-kDa的产物。突变无序环中序列会改变CBASS噬菌体识别的特异性，但并未普遍废除CBASS信号传导，而是影响其对噬菌体蛋白酶功能的感知。

CD-NTase是CBASS免疫中由数千种信号酶组成的一个多样化家族，分为A至H不同的进化枝。不同进化枝的成员通常共享不到20%的序列同一性，且没有明确的结构特征来区分每个进化枝，但所有CD-NTase酶都共享一个能够合成环核苷酸信号的催化核心。为了确定感知蛋白酶活性是否在整个CBASS免疫中普遍存在，按同一性对来自每个进化枝的CD-NTase蛋白序列进行聚类，并结合实验和AlphaFold3预测结构的分析，在每个聚类中搜索潜在激活环的保守模式。结果显示，约24%的CBASS操纵子中的CD-NTase在与EcCdnG激活环相同的三维位置具有一个大的表面暴露激活环。激活环存在于进化枝A和G中几乎所有CD-NTase序列中，以及进化枝D中约18%的序列中。进一步研究显示，CD-NTase激活环的蛋白水解切割是多种细菌共享的广泛激活机制，并且还表明检测噬菌体蛋白酶是控制CBASS免疫信号的主要触发因素。

总的来说，这项研究将噬菌体蛋白酶活性确定为CBASS抗噬菌体防御的主要触发因素，且通过检测蛋白酶活性来感知噬菌体成熟是CBASS免疫中广泛保守的激活机制。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aeg3949

制版人： 十一

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