联手唐本忠院士！浙江大学JACS：核壳结构调控三嵌段共聚物空间相互作用，实现深红簇发光与活体双光子成像

传统有机荧光染料和绿色荧光蛋白（GFP）推动了生物成像发展，但兼具生物相容性、结构可编程性和本征长波长发光的荧光团仍然稀缺。附件指出，簇发光（CL）可在无扩展π共轭的非共轭骨架中，通过孤立功能团或离散芳香片段的空间聚集产生可见光发射，相邻亚基间的空间共轭（TSC）和空间电荷转移（TSCT）可促进本征长波长发射。然而，CL簇的精确尺寸和形貌仍不清晰，更关键的是，在聚集体层面精细控制簇结构尚未实现；现有碳水化合物和多肽体系的结构调控多限于分子层面或链的二级结构，更高阶组装难以操控，导致CL材料性能可调性有限，尤其在深红发射和高光致发光量子产率（PLQY）方面仍面临挑战。因此，在聚集体层面精确构建簇结构，是CL材料发展和聚集科学推进共同面临的关键挑战。

浙江大学张浩可研究员、张鉴予研究员和香港中文大学（深圳）唐本忠院士、澳门大学徐昌活助理教授‌合作，开发可控一锅聚合策略，构建可自组装成核壳簇的非共轭三嵌段共聚物；通过调节共聚物链的亲疏水平衡，精确调控核壳比（core-to-shell ratio）、链堆积和电子空间相互作用，实现可调CL并延伸至深红和近红外区域；超快光谱揭示核壳簇的激发态动力学及电子态与结构耦合演化对CL产生的控制；核壳簇还可实现双光子激发下的活体血管成像。该研究将核壳工程确立为高效簇发光体的通用设计原则，并为下一代纳米荧光技术提供思路。相关论文以“Core–Shell Structures Govern Through-Space Interactions in Triblock Copolymers toward Deep-Red Clusteroluminescence”为题，发表在JACS上。

在方法上，研究首先通过模块化设计构建均聚物、二嵌段和三嵌段共聚物，并以一锅顺序聚合合成由聚酯（PES）、多肽（PP）和聚醚（PE）段组成的三嵌段共聚物（图1a、图1b）。以ABC-1为例，将邻苯二甲酸酐、环氧丙烷和肌氨酸N-羧基内酸酐引入体系，加入三苯基膦引发剂和三乙基硼烷路易斯酸助催化剂，在干燥氮气、60℃、密封耐压管中本体反应24 h，逐步生成PES、PP和PE段（图1b）。原位红外和时间分辨核磁共振验证了PES先形成、PP1后形成，时间分辨核磁共振进一步显示PE段在约9 h后形成（图1c–e）；密度泛函理论计算自由能剖面也支持该逐步反应顺序（图1f）。这一可控一锅聚合方法为后续在聚集体层面调控核壳结构提供了合成基础。

图1 三嵌段共聚物的设计、合成与表征。(a) 三类非共轭聚合物的设计，包括A-1和A-2均聚物、AB-1和AB-2二嵌段共聚物，以及ABC-1、ABC-2和ABC-3三嵌段共聚物。(b) 以一锅顺序合成三嵌段共聚物的示意图，以ABC-1为例。将邻苯二甲酸酐、环氧丙烷和肌氨酸N-羧基内酸酐引入反应体系，随后加入三苯基膦引发剂和三乙基硼烷路易斯酸助催化剂。通过逐步聚合获得三嵌段共聚物，生成聚酯、多肽和聚醚段。反应在干燥氮气气氛、60℃、密封耐压管中本体条件进行24 h。图中给出ABC-1（TPP-PES-PP1-PE）的代表性化学结构。(c) 原位红外光谱监测代表性共聚物ABC-1在一锅反应过程中嵌段序列的演化。(d) 1728和1658 cm⁻¹处特征红外吸收谱带的动力学曲线，分别对应聚酯和多肽PP1段的形成；1790和981 cm⁻¹处分别对应邻苯二甲酸酐/肌氨酸N-羧基内酸酐和肌氨酸N-羧基内酸酐的消耗。(e) 在60℃一锅聚合不同反应时间（8–12 h）分离的纯化聚合物固体的¹H NMR谱。纯化样品溶于CDCl₃进行¹H NMR分析。每个时间点先将粗产物溶于THF（1 mL）并沉淀入水（50 mL），该纯化过程重复两次后进行NMR表征。8 h前获得的产物因分子量不够高，无法通过该沉淀过程纯化。左侧显示纯化12 h产物的全范围¹H NMR谱，与支持信息中ABC-1的谱图密切匹配。约3.5 ppm处特征共振归属为PE段，确认其在聚合后期（约9 h后）形成。(f) 计算得到的一锅合成路径吉布斯自由能剖面，显示不同嵌段逐步形成过程中的关键中间体（IM1–IM7）和过渡态（TS1–TS5）。

随后，研究用时间依赖光致发光光谱跟踪ABC-1形成过程，发现最大发射波长随聚合时间从480 nm连续红移至600 nm，总体红移约120 nm，并与数均分子量增长相关；未纯化和两次纯化产物的发射谱几乎一致，证明荧光演化来自聚合物物种而非残留单体、低聚物或其他小分子中间体（图2a–d）。这一结果说明，三嵌段结构的逐步构建增强了非共轭段之间的空间相互作用，为核壳组装与CL调控建立直接联系。

图2 ABC-1聚合过程中光致发光的时间依赖演化。(a) 不同聚合时间（0–10 h）收集的反应混合物在日光（上）和365 nm紫外照射（下）下的数字照片，显示发光聚合物产物逐步形成及红移荧光演化。8和10 h产物在光致发光测量前纯化。(b) 不同聚合时间收集样品的时间依赖光致发光光谱。早期阶段（0–6 h）分析粗反应混合物，8和10 h收集样品在光致发光测量前按时间分辨¹H NMR分析所述相同程序纯化（溶于THF后沉淀入水，重复两次）。最大发射波长在10 h内从480 nm连续红移至600 nm，总体位移约120 nm。(c) 数均分子量和最大发射波长随聚合时间变化的相关性。分子量逐步增加伴随发射逐渐红移。(d) 聚合10 h后未纯化和两次纯化聚合物产物的光致发光光谱比较。几乎相同的发射谱表明，观察到的荧光演化源于聚合物物种，而非残留单体、低聚物或其他小分子中间体。

在自组装结构上，研究用透射电子显微镜、受激发射损耗荧光、能量色散X射线光谱和分子动力学模拟表征水相簇结构（图3a–j），并用动态光散射评估胶体稳定性。非两亲性均聚物只形成不规则聚集体，而两亲性二嵌段和三嵌段共聚物形成球形簇，三嵌段呈现更明显的核壳形貌；随PP段疏水性从PP1到PP3增强，核/总半径比（Rcore/Rtotal）逐步降低，ABC-3可降至约0.61，表明核心逐步压实（图3a–f）。磷信号主要定位于ABC-1簇中心，与疏水TPP-PES段的核心限域一致（图3g）。分子动力学统计进一步显示PE段位于外层、TPP-PES段位于内层，PP段随疏水性增强向内迁移，PP与水之间的氢键减少，核心TPP-PES段不可被水接近（图3h–j）。动态光散射还表明，核心最压实的ABC-3结构稳定性最高、保持完整时间最长。该部分确立了“多肽疏水性—核心压实—核壳形貌—胶体稳定性”的方法与结论链条。

图3 (a–f) 亲脂性A-1和亲水性A-2、两亲性二嵌段共聚物AB-1和AB-2、两亲性三嵌段共聚物ABC-1、ABC-2和ABC-3组装簇的透射电子显微镜图像和受激发射损耗荧光图像。(g) 沿黄线跨ABC-1代表性球形颗粒获得的能量色散X射线光谱线扫描剖面，显示碳、氧和磷的空间元素分布。插图为磷元素的放大剖面。(h) ABC-1到ABC-3核壳结构核心逐步压实的示意图。采用以模拟盒中心为中心、半径4 nm、含15条聚合物链和2800个水分子的球形区域进行分析。基于分子动力学模拟结果，统计量化0–18和18–40 Å区域内嵌段分布。(i) 模拟ABC-1、ABC-2和ABC-3簇中聚酯、多肽和聚醚段在0–18和18–40 Å区域内的统计分布。(j) 模拟ABC-1、ABC-2和ABC-3簇中不同嵌段与H₂O之间形成的氢键数。

在光物理与激发态动力学上，研究结合激发依赖发射光谱、PLQY和飞秒瞬态吸收全局拟合解析核壳簇的CL来源（图4a–j）。三嵌段共聚物在稀溶液中基本不发光，说明水相组装对激活CL至关重要；随PP段疏水性增强，CL从ABC-1的绿色红移至ABC-2的橙红约606 nm，再到ABC-3的深红约662 nm，ABC-2的PLQY可达20%，ABC-3因额外羰基进一步红移但PLQY降至5%（图4a–c）。飞秒瞬态吸收解析出S₁态的三个连续物种A、B、C态：ABC-1和ABC-2仅在C态出现CL相关受激发射，而ABC-3在B态已出现明显受激发射，说明更强空间相互作用使其在更早激发态阶段产生CL（图4d–f）。全局拟合显示A到B为超快电子态转变，B到C为结构松弛，且ABC-1到ABC-3的松弛逐步延长，与链堆积更紧密相一致（图4g–i）；重组能计算也支持结构刚性逐步增加。据此提出的模型表明，光激发后先形成表现为酰胺等功能团上局域电子离域的A态，随后形成弱TSC/TSCT的B态，结构松弛进一步增强空间相互作用并在C态产生CL；ABC-3因更紧密堆积和额外羰基在B态即具备足够强空间相互作用（图4j）。该部分的方法和结论共同表明，核壳结构可通过调控核心链堆积来控制激发态动力学和CL性质。

图4 核壳簇的激发态动力学演化。(a–c) 水中的ABC-1、ABC-2和ABC-3簇（3 mg/mL）的激发依赖发射光谱、365 nm紫外照射下荧光图像和光致发光量子产率。(d–f) 飞秒瞬态吸收等高线图（泵浦：515 nm；探测：480–800 nm）及相应物种相关光谱：ABC-1、ABC-2和ABC-3水性簇（3 mg/mL）。A/B/C态代表全局拟合解析出的三种与S₁相关的物种。(g–i) 从全局拟合分析提取的物种浓度时间演化：ABC-1、ABC-2和ABC-3簇。泵浦脉冲持续时间90飞秒由仪器响应函数拟合（灰色虚线）估计。拟合优度由实验与拟合数据之间的均方根残差评价。(j) 非共轭聚合物形成的簇的激发态动力学及簇发光产生过程示意图。绿色圆圈表示氧原子，蓝色圆圈表示氮原子。

在应用上，研究进一步展示双光子簇发光和活体生物成像（图5a–h）。ABC-1、ABC-2和ABC-3固体粉末均具有双光子簇发光，且双光子激发下发射对激发波长的依赖性更明显；随激发波长从960 nm增至1200 nm，ABC-1和ABC-2发射最大值分别红移至655 nm和650 nm，ABC-3在单光子和双光子激发下均呈现约700 nm近红外发射（图5a–c）。由于ABC-2具有最高PLQY，研究用PS₅₀₀₀-b-PEG₅₀₀₀包封构建核壳CL纳米粒子，透射电镜（图5d）和动态光散射（支持信息）确认其簇结构至少稳定17天，包封后仍保留激发依赖的双光子发射。双光子活体血管成像在0–50 μm深度分辨出明亮血管信号，20 μm深度信噪比达19.97，沿跨血管黄线提取的荧光强度剖面换算得到横向距离13.3 μm（图5e–f）。苏木精-伊红染色显示主要器官无明显病理异常，实验组与对照组血清生化指标无显著差异，支持其良好体内生物相容性（图5g–h）。该部分将核壳CL材料从结构设计和机理研究推进到双光子生物成像应用。

图5 核壳共聚物的双光子簇发光和活体血管成像。(a–c) ABC-1、ABC-2和ABC-3固体粉末的双光子激发依赖发射光谱，显示发射最大值逐步红移。(d) 用PS₅₀₀₀-b-PEG₅₀₀₀包封后获得的ABC-2核壳纳米粒子的双光子激发依赖发射光谱和透射电子显微镜图像。(e) 使用所制备核壳纳米粒子在不同深度进行双光子活体血管成像（λₑₓ = 1000 nm）。(f) 在20 μm深度沿跨血管黄线提取的血管成像荧光强度剖面。(g) 核壳CL纳米粒子处理后主要器官的组织学分析。(h) 实验组和对照组的血清生化指标，包括天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、尿素、肌酐、总蛋白、白蛋白和球蛋白，显示两组之间无显著差异（n=6；ns，不显著）。

小结：该研究以可控一锅聚合构建可编程核壳簇的非共轭三嵌段共聚物，通过亲疏水平衡精确调控核壳组织、链堆积、空间相互作用和光物理性质，使ABC-2获得明亮红色发射和高PLQY，ABC-3获得本征深红发射；飞秒瞬态吸收解析了S₁态内电子态与结构重组的耦合演化，建立了核壳结构与CL产生之间的直接关系；双光子簇发光和活体生物成像则把工作从结构设计、机理研究延伸至生物应用。总体而言，该研究为非共轭簇发光体提供了合成框架和机理基础；凭借本征深红/近红外发射、良好生物相容性和生物成像能力，这类材料有望成为下一代纳米荧光团，并为超越传统GFP衍生系统的未来荧光平台开辟道路。