Phytomedicine: 浙大二院以网络药理学-黄芪来源的槲皮素自组装水凝胶改善糖尿病创面快速愈合

【写在前面】：本期推荐的是由浙江大学医学院附属第二医院近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，揭示基于网络药理学指导的黄芪来源槲皮素自组装水凝胶可加速糖尿病创面愈合。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Network pharmacology-guided self-assembling quercetin hydrogel from Astragalus membranaceous accelerates diabetic wound healing

研究亮点

1. 网络药理学结合分子对接，确定槲皮素为黄芪促糖尿病创面愈合关键活性成分。

2. 制备 QNPs@GelMA 复合水凝胶，改善槲皮素理化短板，实现药物缓释。

3. 通过调控 RAGE/NF‑κB 通路，发挥抗炎抗氧化、调控巨噬细胞、促血管生成、抗凋亡作用，加速创面修复。

4. 建立中药活性成分到功能敷料的转化思路，为糖尿病伤口治疗提供新候选材料。

研究背景：

糖尿病伤口愈合延迟仍是临床上面临的重大挑战。黄芪（Astragalus membranaceus）作为一种传统中药，已被广泛用于糖尿病伤口的局部治疗。然而，其复杂的化学成分结构阻碍了对其主要活性成分的鉴定及确切作用机制的阐明。本研究旨在鉴定黄芪中负责促进糖尿病伤口愈合的主要活性成分，并开发一种先进的纳米复合递送系统，以增强其治疗效果。

研究方法：

本研究主要活性成分及其核心治疗靶点通过网络药理学方法进行筛选，并借助分子对接技术加以验证。为克服已鉴定成分的固有局限性，本研究通过自组装法制备了负载槲皮素的壳聚糖纳米粒（QNPs），随后将其整合至明胶甲基丙烯酰化（GelMA）水凝胶中，最终形成 QNPs@GelMA。QNPs@GelMA 的治疗效果通过多种技术手段在体外及体内进行了系统评估，包括活性氧检测、组织病理学染色、免疫荧光染色及 TUNEL 染色。

研究结果：

1.槲皮素是黄芪的主要活性成分。

本研究通过 TCMSP 软件，以 OB≥30%、DL≥0.18 筛选膜质黄芪（*A. membranaceous*）潜在活性成分，得到 17 种候选成分，鉴定出 201 个药物潜在药效靶点和 3846 个糖尿病伤口相关靶点，维恩图得到 150 个交集靶点；借助 Cytoscape 构建 “药物 - 成分 - 靶点” 网络，拓扑分析发现槲皮素度值最高，推测其为膜质黄芪治疗糖尿病创面的主要活性成分，进一步筛选得到槲皮素与糖尿病伤口的 114 个共有基因，构建 PPI 网络并经拓扑分析，筛选出 TNF、JUN、IL6、IL1β、TP53 为核心靶点；GO 富集提示靶点主要参与转录调控、低氧反应等生物学过程，KEGG 富集显示 AGE-RAGE、IL-17、p53、TNF 及内分泌抵抗相关通路可能介导槲皮素的创面修复作用。尽管黄芪多糖、黄芪甲苷 I 等也是膜质黄芪已知活性物质，但体外高糖模型对比槲皮素、山奈酚、黄芪多糖及黄芪甲苷 I 的活性发现，槲皮素改善高糖损伤、促细胞迁移、清除 ROS 的效果最优，与网络药理学预测结果相符，因此选定槲皮素开展后续糖尿病创面愈合研究。

2. 槲皮素与核心蛋白的分子对接研究

基于 PPI 网络筛选得到 TNF、JUN、IL6、IL1β、TP53 五大核心靶标，将其与槲皮素开展分子对接，计算结合自由能：TNF（−7.6 kcal/mol）、JUN（−5.2 kcal/mol）、IL6（−5.4 kcal/mol）、IL1β（−7.0 kcal/mol）、TP53（−4.6 kcal/mol），结合自由能负值越大代表结合亲和力越强；构象分析证实槲皮素可分别与各靶标关键氨基酸残基形成氢键，提示槲皮素作为膜质黄芪主要活性成分，可与糖尿病创面修复核心靶标稳定结合。

3.量子纳米颗粒的制备与表征

采用离子凝胶法，利用壳聚糖与 TPP 静电自组装制备包载槲皮素的 QNPs。QNPs 包封率 98.55 ± 0.56%，载药量 19.54 ± 0.05%；TEM 可见球形规则颗粒，DLS 测得 QNPs 平均粒径 222.0 ± 7.57 nm、PDI 0.20、Zeta 电位 + 41.34 ± 0.98 mV，胶体稳定性良好。FTIR 证实槲皮素成功包封；静置与丁达尔效应实验表明 QNPs 分散液稳定性优于游离槲皮素。DPPH 及 RAW264.7 炎症模型 ROS 检测显示，QNPs 抗氧化活性显著高于空白 CNP 且呈剂量依赖性；游离槲皮素易光降解，而 QNPs 包载可有效保护槲皮素，维持其光照后的抗氧化能力。

4.QNPs@GelMA的制备与表征

将不同浓度 QNPs 混入 GelMA 溶液，经紫外交联制备 QNPs@GelMA 水凝胶。SEM 证实水凝胶呈多孔结构，平均孔径 57.36 ± 13.89 µm；溶胀实验显示冻干水凝胶 48 h 达平衡溶胀，溶胀率超 1000%，中性条件溶胀最优，酸性条件最弱，各组溶胀率无显著差异。降解实验表明 QNPs@GelMA 可维持 25 天以上结构完整，能持续提供创面机械支撑。Franz 扩散池实验证明 QNPs 及 QNPs@GelMA 的皮肤渗透能力优于游离槲皮素与 Que@GelMA。体外释药：游离槲皮素 8 h 快速释放完全；QNPs 符合一级动力学模型，24 h 累积释放约 95%；QNPs@GelMA 遵循 Higuchi 扩散控释模型，48 h 释放趋于平稳。压缩测试表明 QNPs@GelMA 抗压强度为 113.20 ± 21.79 kPa，满足伤口敷料力学要求；游离槲皮素会破坏 GelMA 交联网络，使 Que@GelMA 力学性能最差。

5.QNPs 及 QNPs@GelMA 的生物相容性

采用 CCK-8 与活 / 死细胞染色评价 QNPs 及 QNPs@GelMA 水凝胶的细胞相容性：RAW264.7 和 HUVECs 在 100 μg/mL QNPs 下细胞存活率最优；200 μg/mL 时 HUVEC 活性无明显变化，但 RAW264.7 细胞活性显著下降。水凝胶提取物共培养的活死染色结果显示活细胞占绝大多数，细胞相容性良好。溶血实验表明各组水凝胶溶血率均低于 10% 安全界限，血液相容性佳。小鼠皮下植入实验显示，术后 7 天水凝胶结构完整，局部无红肿出血；H&E 染色提示周围仅有轻度炎症浸润，血清肝肾功能指标（ALT、AST、尿素、肌酐）与对照组无统计学差异，无明显肝肾毒性。综上，QNPs@GelMA 水凝胶具备良好生物安全性，适用于创面修复。

6. QNPs@GelMA 的体外多功能评估

过量 ROS 引发的氧化应激与持续炎症会延缓创面愈合。LPS 诱导 RAW264.7 细胞模型中 DCFHDA 检测显示，QNPs@GelMA 可浓度依赖性清除 ROS，效果优于 GelMA 与 CNPs@GelMA；TBHP 氧化应激模型同样验证其降 ROS 作用，且 QNPs@GelMA 具备 SOD、CAT 样活性，可清除 ROS 并提升内源性抗氧化能力。细胞划痕实验表明，QNPs@GelMA 促细胞迁移效果最优，24 h 划痕闭合率达 49.68 ± 3.43%，约为对照组 2.7 倍，有利于再上皮化。ELISA 结果显示 QNPs@GelMA 可剂量依赖性抑制 LPS 诱导的 TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌；qPCR 热图证实其能下调 TNF-α、IL-1β、IL-6、JUN、p53、MAPK、RAGE mRNA 表达，抑制效果强于 CNPs@GelMA，体外抗炎作用突出。高糖 HUVEC 损伤模型进一步验证，QNPs@GelMA 可恢复高糖损伤内皮细胞的增殖与迁移，缓解氧化应激，下调促炎 IL-6、上调抗炎 IL-10，改善糖尿病创面微环境。

7.QNPs@GelMA 水凝胶促进糖尿病伤口愈合

为验证 QNPs@GelMA 水凝胶体内治疗效果，本研究构建糖尿病小鼠全层皮肤创面模型，将动物分为对照组、GelMA 组、CNPs@GelMA 组、Que@GelMA 组、QNPs@GelMA 组，分别在第 0、3、7、14 天记录创面。愈合前期各组创面闭合率差异小，后期差异明显；14 d 时 QNPs@GelMA 组愈合最优，创面闭合率达 97.30±1.28%，其余各组愈合程度依次降低。组织学染色结果显示，QNPs@GelMA 组创面完全上皮化，胶原纤维含量高、排列规整，证实该水凝胶可促进上皮再生与胶原沉积，加快糖尿病创面愈合。

STZ 造模通过破坏胰岛 β 细胞造成胰岛素缺乏，难以模拟 2 型糖尿病胰岛素抵抗、肥胖的病理特点；db/db 小鼠因瘦素受体突变，可表现肥胖与胰岛素抵抗，更适合 2 型糖尿病研究。利用 db/db 小鼠进一步验证，QNPs@GelMA 同样可加速创面修复，14 d 创面闭合率 95±4.12%，组织学也呈现完全上皮化、胶原沉积增多的结果，与 STZ 模型结果一致。

8.QNPs@GelMA 的体内免疫调节、促血管生成及抗凋亡功效

巨噬细胞表型从促炎状态向促愈合状态的动态转变，是伤口愈合进程的关键调控因素（Aitcheson 等，2021）。为评估本治疗方案对该过程的影响，我们对伤口组织中的M1标志物CD86及M2标志物CD206进行了免疫荧光染色（图8A和B）。荧光分析显示，糖尿病伤口中M1巨噬细胞高表达，而M2巨噬细胞低表达。这一现象证实，高血糖环境通过过度激活M1巨噬细胞，并阻碍巨噬细胞从促炎性M1向抗炎性M2极化，从而延缓伤口愈合。值得注意的是，与所有其他组别相比，QNPs@GelMA水凝胶治疗组中CD206表达显著升高，CD86表达显著降低，表明QNPs@GelMA促进M2巨噬细胞极化的能力更强（p < 0.05）。新生血管形成亦是评估伤口愈合质量的重要指标（Byun 等，2024）。我们在伤后第7天通过内皮细胞标志物CD31染色进行评估（图8C和D）。免疫荧光分析显示，QNPs@GelMA组中CD31表达较其他组别显著增加，证明其在加速新生血管形成方面具有更优效果（p < 0.05）。高糖环境诱导的氧化应激可引发伤口周围细胞过度凋亡，最终导致细胞功能障碍及再生能力受损（Song 等，2023）。为评估QNPs@GelMA的抗凋亡作用，我们采用 TUNEL 染色法，通过细胞DNA特征性片段化检测凋亡细胞。如图8E和F所示，对照组与GelMA组中均存在大量 TUNEL 阳性（绿色染色）细胞，证实糖尿病状态会促进细胞凋亡，而单独使用水凝胶支架则无保护作用。相比之下，使用CNPs@GelMA、Que@GelMA及QNPs@GelMA处理时，凋亡细胞数量均显著减少。值得注意的是，QNPs@GelMA组对凋亡的抑制作用最为显著，凸显其在抑制高糖诱导的细胞凋亡中的附加作用。为阐明QNPs@GelMA在 TUNEL 检测中表现出的抗凋亡效应背后的机制，我们进一步探究了伤口组织中晚期糖基化终末产物受体（RAGE）及其关键下游信号介质——核因子κB（NF -κB）的蛋白表达水平（图8G和H）。Western blot分析显示，与对照组及其他处理组相比，QNPs@GelMA处理组中RAGE与 NF -κB的蛋白表达均显著下调（p < 0.05）。这些研究结果表明，QNPs@GelMA 水凝胶可抑制 RAGE/ NF -κB 信号通路，从而抑制炎症反应与细胞凋亡。

总结

本研究结合传统草药与功能生物材料开展糖尿病创面修复研究。借助网络药理学筛选出膜荚黄芪中治疗糖尿病创面的主要活性成分槲皮素；针对槲皮素水溶性差、光稳定性不足的缺陷，采用离子凝胶法制备载槲皮素壳聚糖纳米颗粒（QNPs），复合光交联 GelMA 水凝胶得到 QNPs@GelMA 敷料，实现药物高效负载与缓释。体外体内实验证明该材料抗氧化、生物相容性良好。QNPs@GelMA 可下调 RAGE/NF‑κB 信号通路，通过促进上皮再生、胶原沉积、巨噬细胞促再生极化、血管生成及抑制细胞凋亡，加速糖尿病创面愈合。本研究建立从成分筛选到应用的转化方案，为融合传统草药与现代生物材料的创面敷料研发提供新思路。

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