Vita Microbiology丨“改完即走”的可擦除基因编辑工具助力放线菌天然产物工程改造

放线菌（Actinomycetes）基因组中蕴藏着丰富多样的次级代谢产物生物合成基因簇，为活性天然产物发现和开发提供了宝贵资源。将这些微生物的资源潜力转化为可利用的生物合成能力，往往需要涉及功能基因、调控基因及代谢通路等多重改造。然而，大量非模式放线菌仍存在外源DNA递送效率低、难以遗传操作等客观困境。

源自噬菌体的 位点特异性重组可介导外源 DNA 在放线菌染色体特定识别位点实现高效整合，但整合型载体也由此将抗性标记、整合酶和基因编辑器等功能元件滞留于染色体中，从而留下隐患。因此，如何取长去短，利用整合型载体有效完成预期基因改造，然后彻底地清除载体及其携带的功能元件，是放线菌代谢工程需要解决的实际难题。

Cre-loxP 重组系统借助重组酶Cre能够准确切除两个同向识别位点loxP之间的DNA，但Cre的额外递送显然增加了遗传操作步骤和难度，若将Cre与其它功能元件同时引入，则需要严格把控重组时机，否则Cre的泄露表达将引发新的问题。

近日，华中科技大学药学院孙宇辉教授研究团队在Vita Microbiology上发表了题为Base editing trigger-induced erasable gene-editing tools enhance hit-and-run genome engineering in actinomycetes 的研究论文。该研究开发的可擦除碱基编辑（Erasable base editor,EraBE）系统，通过碱基编辑事件门控Cre重组酶功能，为放线菌建立了衔接高效遗传递送、基因改造和质粒消除的工程路径，并在天然产物高产和异源表达应用场景中得到了成功体现。

核心设计：基于碱基编辑事件开启重组酶功能

在绝大部分放线菌中广泛分布的位点特异性重组系统，让EraBE能够在众多放线菌中实现高效且稳定的基因组整合，特别是在遗传背景复杂、遗传操作系统极为困难的工业放线菌中。完成基因组整合后，EraBE的碱基编辑模块即可高效且

高保真地进行胞嘧啶或腺嘌呤编辑，定向完成目的碱基转变、氨基酸转变和基因失活等既定任务。有别于传统的整合型载体，EraBE不仅能有效整合至基因组上，还可以简洁地诱导表达正交Erasing sgRNA，引导碱基编辑器修复预先功能失活的Cre重组酶（Dead Cre, dCre），而恢复活性的Cre随后可将整合在基因组上的质粒自我擦除，仅留下loxP和attB-attP序列，并在后续的发酵或迭代基因改造中展现出良好的基因组稳定性和安全性。

EraBE系统的工作原理示意图

EraBE设计的巧妙之处在于将事先经过失活突变的重组酶dCre需经过编辑修复后才能实现功能重启。为实现这一想法，本研究首先在Cre的关键催化残基中引入失活突变，获得dCre。同时，这些突变又被设计为可由碱基编辑回复修复（EraCBE修复为H289R、EraABE修复为R173Q）。通过诱导表达正交的Erasing sgRNA，即可引导编辑器将失活的dCre恢复活性，从而切除引入的载体骨架。相较于直接诱导表达Cre重组酶，诱导型启动子难以避免的本底泄露表达将造成质粒骨架的提前重组，这一设计为基因编辑和质粒清除的先后顺序提供了额外控制。此外，对遗传操作困难的放线菌而言，EraBE也无需二次递送Cre重组酶，极大简化了繁琐费时的遗传操作。

概念验证：EraBE系统在放线菌宿主中的成功测试

该研究首先在模式菌株Streptomyces coelicolor M145中对EraBE系统进行了概念验证。EraCBE和EraABE均能够在目标位点实现预期的单碱基转换，部分碱基的编辑效率可达100%。随后诱导Erasing sgRNA恢复Cre活性并清除整合的载体骨架，EraCBE和EraABE的骨架擦除率分别可达67.78%±22.69%和93.33%±6.67%。

为了测试该系统在放线菌宿主中普适性，该研究进一步将EraCBE应用于遗传操作效率较低的氨基糖苷类抗生素庆大霉素（Gentamicin）产生菌——Micromonospora echinospora ATCC15835。在该宿主中，EraCBE同样实现了预期的载体清除，平均擦除率为13.33%±6.67%。虽然效率低于模式菌株S. coelicolor M145，但这一结果表明EraBE的核心工作流程仍能够在系统发育距离较远的其它放线菌中正常运行。

功能拓展：基于EraBE系统的生物合成基因簇的异源表达

该研究还进一步测试了EraBE系统在清除递送载体的同时，将外源目标功能基因定植于染色体上实现异源表达。本研究以EraABE作为载体，将编码可促进多种天然产物生物合成的吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone, PQQ）生物合成基因簇克隆至载体的attP与loxP之间，最终使Cre只切除非必要的载体骨架，而将pqq生物合成基因簇 稳定整合于S. coelicolor M145染色体中。

结果显示在随机检测的5个单菌落中均为预期的无载体基因型，Sanger测序进一步确认pqq生物合成基因簇成功整合于S. coelicolor M145染色体中，且菌株产生的十一烷基灵菌红素（Undecylprodigiosin）超过对照菌株的2倍。这说明EraBE不仅可以用于“改完即走（hit-and-run）”的基因编辑，还能作为稳定的递送工具实现目的基因的无载体残留异源表达。

高产应用：EraBE系统助力非模式菌株中天然产物高产

为了突显该系统在实际中的应用价值，该研究随后将EraCBE应用于非模式菌株——聚酮天然产物阿扎霉素产生菌Streptomyces sp. 211726。以参与形态分化和次级代谢调控的wblA基因为靶点，通过碱基编辑将其中的色氨酸密码子突变成提前终止密码子。获得的突变株表现出明显的光秃、孢子形成缺失和菌落颜色变化等形态，暗示目标调控基因已被有效失活。诱导载体擦除后，随机检测的15个单菌落中有12个呈现预期基因型，获得稳定的无载体突变株。

发酵与代谢分析结果还显示，基因wblA失活后多种天然产物同步提高：具有抗真菌活性的Azalomycin F3a、F4a和F5a产量分别提高了11.42、20.89和18.59倍， 具有抗菌性和抗肿瘤活性的Elaiophylin产量提高了1.89倍，同样具有抗菌性和抗肿瘤活性的Nigericin的产量提高了3.99倍。

EraBE系统不仅是一个基于整合型载体的高效、高保真碱基编辑工具，还能够兼顾基因簇的异源表达，并在完成任务后改完即走，不留后患。EraBE系统在提高遗传递送可靠性的同时，减少编辑器、抗性标记和整合酶等非必要元件的长期残留，提供了一种具有拓展潜力的“hit-and-run”工程框架。

华中科技大学药学院孙宇辉教授为该论文的通讯作者，王建博士（现为上海交通大学博士后）和华中科技大学硕士毕业生程贝为该论文的共同第一作者。

原文链接：https://www.vita-journal.com/microbiology/EN/10.2738/vita.microbiology.2026.09.0001

杂志主页：https://www.vita-journal.com/microbiology/EN

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