场景恐惧实验系统 | 年龄相关的LRRK2 G2019S突变影响小胶质细胞多巴胺能纤维细化和参与异常行为的突触修剪

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富含亮氨酸重复激酶2 (LRRK2) 基因的突变是常染色体显性帕金森病 (PD) 的最常见原因，可产生精神和运动症状。我们通过采用中青年PD模型小鼠进行本研究，旨在探讨小胶质细胞多巴胺能纤维细化和突触修剪是否与LRRK2 G2019S突变携带者的异常行为表型有关。本文的发现表明，LRRK2 G2019S突变诱导炎症细胞因子的产生，并介导异常的小胶质细胞形态发生和活性，导致衰老过程中吞噬作用异常、突触修剪和DAergic纤维丢失，最终导致PD相关的行为异常。

1.LRRK2 G2019S突变小鼠和WT小鼠衰老过程中不同的行为表现

为了评估LRRK2功能障碍对年龄依赖性行为改变的影响，我们对2个月和10个月大的WT和Lrrk2−G2019S小鼠进行了一系列行为测试。发现2个月大的Lrrk2−G2019S小鼠在开放区域中心花费的时间显著减少（图1a和c）。同时，与年龄匹配的对照组相比，中年Lrrk2−G2019S小鼠有更快的速度移动（图1e和f）。 圆柱体实验显示，2或10个月大的WT或Lrrk2−G2019S小鼠的前爪偏好没有明显的不对称性（图1g）。通过足迹分析评估步态测试发现与年轻小鼠相比，老年WT和Lrrk2−G2019S小鼠的步态存在明显差异，包括较短的步幅距离（图1h和i）、较宽的摇摆距离（图1h和k）和较长的站立距离（图1h和j）。

图1 LRRK2 G2019S突变小鼠和WT小鼠衰老过程中的行为表现。

2.LRRK2 G2019S突变引起小鼠衰老过程中独特的小胶质细胞形态变化

由于大脑LRRK2在小胶质细胞中大量表达，所以我们进行了定量形态学分析，并通过对2个月龄和10个月龄的Lrrk2−G2019S和WT小鼠进行骨髓细胞标记物、离子钙结合接头染色，比较了PFC和DS中小胶质细胞过程生长的复杂性。 分子1 (Iba1)（图2）。

分析显示，Lrrk2−G2019S动物的小胶质细胞形态更加复杂，2月龄时PFC中每个细胞的分支和连接更多（图2a和c)。这种变化一直持续到10个月大时，但差异有所缩小。在DS区域，变化也很明显（图2d和e）。研究结果表明，LRRK2 G2019S突变参与衰老过程中小胶质细胞形态发生的微妙调节。

图2 2个月和10个月大的Lrrk2−G2019S小鼠PFC和DS中小胶质细胞复杂

3.LRRK2 G2019S突变加速背侧纹状体中与年龄相关的DAergic神经纤维损失

接下来我们研究了LRRK2 G2019S突变是否在衰老过程中影响DAergic神经纤维。DS中DA神经元的轴突末端通过DAT/TH染色可视化（图3a）。共聚焦显微镜定量显示，2月龄时，Lrrk2−G2019S组DS中的TH+和DAT密度显著降低（图3b和c)。与10月龄WT小鼠相比，年龄匹配的Lrrk2−G2019S小鼠组的TH+和DAT密度进一步降低（图3b c)。 此外，我们发现在LRRK2 G2019S突变小鼠中，TH+和DAT纤维的密度和荧光强度松散且弱，而与年龄匹配的野生型小鼠中观察到的紧密密度和高荧光强度相反（图3d和e）。总而言之，这些结果表明LRRK2 G2019S突变会导致衰老过程中纹状体中DAergic神经纤维的损失。

图3 Lrrk2−G2019S小鼠背侧纹状体中DAergic神经纤维的表达。

4.LRRK2 G2019S突变触发老化过程中DAergic纤维的过度小胶质细胞细化

鉴于WT组和Lrrk2−G2019S组背侧纹状体小胶质细胞形态的差异，我们接下来评估了小胶质细胞在衰老过程中Lrrk2−G2019S小鼠细化DAergic纤维中的潜在作用。在3D表面积上得到了进一步证实（图4a 和d）。定量分析显示，2个月大的Lrrk2−G2019S小鼠细胞中DAT结构的平均大小、数量和总体积有所增加（图4e和g）。与年龄匹配的WT小鼠相比，Lrrk2−G2019S小鼠细胞中TH+结构的数量和总体积增加（图4h和j)。值得注意的是，与2个月大的Lrrk2−G2019S小鼠相比，10个月大的Lrrk2−G2019S小鼠中观察到吞噬颗粒的平均大小和体积显著增加（图 4h和j）。这些结果表明，小胶质细胞吞噬作用的增加导致Lrrk2−G2019S小鼠中DAT和TH+密度明显降低。

图4 LRRK2 G2019S突变对衰老过程中小胶质细胞DAergic纤维细化的影

5.中年Lrrk2−G2019S小鼠前额皮质兴奋性突触密度增强

为了进一步分析10个月大的Lrrk2−G2019S组过度活跃行为的可能原因，我们重点关注前额皮质。高尔基体染色显示，Lrrk2−G2019S小鼠PFC中的树突棘密度显著高于WT小鼠（图5a和b）。然而，在DS区域，观察到相反的结果（图5a和c）。我们发现10个月大的Lrrk2−G2019S小鼠的突触被严重修剪，这与TH+和DAT的细化一致。

在Lrrk2−G2019S小鼠的小胶质细胞中检测到的PSD95斑点数量明显少于WT 组（图5h和k），同时每个视野的PSD95总量较高（图5d和f)。同时，免疫荧光分析显示，兴奋性突触前标记物VGLUT1的密度增加（图5e和g），并且当 Lrrk2−G2019S小鼠的小胶质细胞中VGLUT1斑点明显下降时，与WT小鼠相比（图 5l和o）。这些结果表明Lrrk2−G2019S小鼠PFC大脑区域小胶质细胞的突触修剪能力下降。

图5 老年Lrrk2−G2019S小鼠PFC中兴奋性突触的表达。

6.LRRK2 G2019S突变改变前额皮质和纹状体中的小胶质细胞和炎症相关分子

上述研究结果表明LRRK2 G2019S突变引发的免疫反应可能是影响PD病理生理的重要因素。为了测试这种可能性，我们分离了大脑区域并提取了RNA，通过RT-qPCR分析来鉴定表达的mRNA。聚类分析显示某些基因的表达水平之间存在明显的关联（图6a和c），表明LRRK2 G2019S突变随着年龄的增长改变了小胶质细胞转录本之间的关系。与年龄匹配的对照相比，10个月大的Lrrk2−G2019S小鼠中Tmem119 mRNA和PU.1 mRNA上调（图6b）。在STR区域，与年龄匹配的对照相比，10个月大的Lrrk2−G2019S小鼠的IFN-γ mRNA上调（图6d）。

图6 Lrrk2−G2019S小鼠PFC和纹状体中炎症和小胶质细胞相关分子的

结论

总之，该研究提供了一种新颖且详细的体内LRRK2突变的小胶质细胞异常形态发生，加深了我们对衰老过程中LRRK2 G2019S PD模型中行为、神经元-小胶质细胞相互作用和分子表型之间关系的理解。 这些发现表明，LRRK2 G2019S突变影响小胶质细胞形态发生和活性，并重塑小胶质细胞炎症分子的转录景观，从而导致小胶质细胞吞噬作用异常、突触修剪和衰老过程中DAergic纤维的丢失，并最终导致PD相关的行为异常。

在该研究中，研究人员使用了赛昂斯场景恐惧实验系统（Sansbio，SA218）来进行实验操作。

作者提示: 个人观点，仅供参考

SA218 场景恐惧实验系统

SA218是一款心理学和神经科学研究中的重要工具，主要用于探究恐惧反应的机制及其在焦虑障碍等心理疾病中的作用。该系统通过模拟特定场景或刺激，帮助研究者分析恐惧的形成与消退过程，评估暴露疗法、认知行为疗法等治疗方法的有效性，并辅助抗焦虑药物的开发。同时，它还能监测心率、皮肤电等生理指标以识别恐惧相关的生物标志物，观察个体行为反应模式，并为心理学教育提供实践支持，从而为理解恐惧的神经心理机制和临床干预提供科学依据。

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