乙肝两对半(ELISA法)操作要点及不当结果分析！

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乙肝两对半（也称为“乙肝五项”）是临床常见的检验项目，目前乙肝五项的检测方法有3大类，一类是定性检测，另外两类就是半定量和定量检测。其中，定性检测有国产乙肝金标法或者采用酶联免疫吸附测定（ELISA）。

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ELISA法和胶体金试纸条检测结果不一致，是何原因？

案例经过

住院患者，男，60岁，因外伤入院，入院查乙肝五项。患者血清无溶血、脂血等异常情况，未使用过特殊药品，实验操作过程无误。ELISA（酶联免疫吸附试验）方法检查结果为乙肝表面抗原（HBsAg）S/CO值1.2，在临界值附近，肉眼观察反应孔几乎不显色。e抗原（HBeAg）和核心抗体（抗—HBc）均阳性，其余两项均阴性，其中HBeAg的S/CO值特别高，远远大于1，肉眼观察反应孔显色也特别深。

e抗原阳性提示病毒有活动，通常在乙肝病毒感染后，表面抗原阳性同时，或其后数天可测得阳性。所以，笔者感觉该患者应为大三阳。若如此，HBsAg的S/CO值应远远大于1.2才对。于是笔者又换用胶体金试纸条检测HBsAg，检测线很快就出来了，且非常明显。

ELISA法和胶体金试纸条检测HBsAg的结果为啥不一致呢？

案例分析

胶体金试纸条和ELISA法的检测原理基本相近，不同的是灵敏度不同。胶体金试纸条法>1ng/ml,而ELISA法<1ng/ml也能检出。本案例为胶体金试纸条可以检出HBsAg而ELISA法却几乎出现了假阴性，由此可判断是出现了后带现象。由于抗原过量，ELISA法中过量的抗原分别与固相抗体和酶标抗体结合，所以此反应不显色。

笔者对该患者血清进行了五倍稀释，随后ELISA法检测HBsAg阳性。该患者为乙肝大三阳。

案例总结

胶体金试纸条检测简单快速，但准确性堪忧。ELISA法操作相比而言繁琐一些，但准确性相对较高。

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乙肝五项(ELISA法)手工操作不当结果分析

随着现代临床免疫学不断发展，酶联免疫吸附试验(ELISA) 因其操作简单、灵敏度高、特异性高等特点而广泛应用于乙肝五项的检测。但在实际工作中，可能会因操作不当而出现一些异常指标。现将一些经验和体会介绍如下：

（1）待检血清应新鲜或冰冻保存,不能污染,否则可出现非特异性反应；较严重溶血,标本易出现假阳性。

（2）在温育时，反应板有时受到异常剧烈的震动，致使有的阳性标本板孔中的液体溅入阴性板孔中，尽管马上洗板，还会造成部分阴性标本的假阳性。原因可能是有时阳性标本浓度太高，种特异性反应比较迅速，一旦失手发生此情况,建议重做。

（3）洗板时：①洗板不彻底，未除去实验中没参与反应的酶类物质,造成HBsAg、HBsAb和HBeAg的假阳性；或HBeAb和HBcAb的假阴性。②加注洗涤液时冲力过大；将包被在固相载体表面的成分脱落导致HBsAg、HBsAb、HBeAg假阴性；或HBeAb和HBcAb的假阳性。

（4）有时我们在加样过程中，常常会遇到别标本未离心等情况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分离好后再加标本，殊不知，这样，竟常常会造成HBeAb和HBcAb的假阴性。因为HBeAb和HBcAb都是竞争抑制法，先加入酶标记的抗体，首先与固相载体上的抗原结合，待加入显色剂后，因酶的存在而显色，故呈阴性。

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板式ELISA技术操作要点

不仅仅是在乙肝五项的检测中，由于ELISA法比较灵敏,不需特殊设备,可以定性分析,所以应用发展迅速。ELISA手工法已成为基层医院免疫检验的常规检验方法。例如：绝大多数医院对HIV抗体的检测都会采用ELISA方法，灵敏度可以达到99%以上。

和其他生物实验一样，ELISA的实验结果也是会受诸多因素的影响从而出现问题。所以优质的试剂，良好的仪器和正确的操作都是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。

ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。接下来小龙将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。

1.标本的采取和保存

可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。

一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

2.

试剂的准备

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

3.

加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

4.

保温

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

最后要提醒各位同行，在我们的工作中一点小小的疏忽、失误都有可能造成检验结果的相悖，给患者及家属带来物质精神上的损失，给临床确诊带来麻烦。因此，作为检验工作人员，工作中要尽量减少失误，严格遵守操作规程，并及时总结经验，提高我们的检验工作水平，为临床提供可靠的诊断依据。

来源：”医学检验沙龙“微信公众号

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