高灵敏比率型表面增强拉曼基底用于快速分析血清中的6-硫鸟嘌呤

1、 简介

6-硫鸟嘌呤（6-Thioguanine，6-TG）作为一种抗肿瘤药物被广泛用于治疗急性白血病，并且通常用于强化治疗阶段。6-TG在人体内被磷酸核糖转移酶催化转变为6-硫鸟嘌呤核糖核苷酸，最后转变成脱氧鸟嘌呤核苷酸，起到抑制DNA合成的作用。同时，因为6-TG是细胞周期特异性药物，对处于DNA合成期（S期）的细胞最敏感，可轻度抑制RNA合成，表现出较好的治疗效果。但是，6-TG在临床使用过程中个体差异大，并且患病情况复杂多变，难以确定最佳用药方案；同时，6-TG还表现出一定的肝毒性和骨髓抑制等副作用。因此，发展新型分析方法实现用药过程中6-TG血药浓度的监测，可为药物代谢动力学研究提供有力工具，具有重要的临床意义。

SERS基底的活性决定了相应分析方法的灵敏度，因此，构建高活性的SERS基底是解决上述问题的基础。最常用的SERS基底的制备方法是“自下而上”的基底组装法，即将制备好的纳米颗粒组装在固体基片上得到SERS基底。纳米颗粒的种类在很大程度上决定了组装后基底的SERS活性，而各向异性的纳米颗粒（如纳米棒、纳米锥和纳米星等）具有更强的等离激元活性，在SERS基底制备中备受青睐。但是，制备此类纳米颗粒时通常需要加入表面活性剂、生物大分子和聚合物等，用于纳米颗粒结构的可控合成，这导致组装的SERS基底也被相应的分子紧密包裹，降低了基底和目标物的亲和力，影响检测的灵敏度。因此，发展兼顾高亲和力和LSPR活性的纳米颗粒用于SERS基底组装，并开发校准基底均匀性的策略，将有利于推进SERS分析法在6-TG血药浓度监测中的应用。本研究采用控制酸度和加入Ag+的方法，制备了具有丰富尖端和间隙结构的金纳米星（Goldnanostars，AuNSs，图1），避免了表面活性剂和大分子物质的引入。AuNSs的纳米“触手”之间仅有几纳米的间隙，可发生强LSPR，能大幅增强间隙中的电磁场，适用于SERS分析。以二水合双（对磺酰苯基）苯基膦分子（Bis（P-sulfonatophenyl）phenylphosphine hydrate dipotassium salt，BSPP）为保护剂，将三价磷配位在AuNSs表面提高材料的稳定性；同时，BSPP表现出较强的SERS信号，可作为内标分子辅助6-TG的定量分析。不同于传统方法依赖的表面活性剂和大分子，BSPP和AuNSs的亲和力略弱于6-TG，因此，在硅片表面组装AuNSs-BSPP用于SERS分析时，BSPP不会影响6-TG在基底表面的结合。同时，BSPP分子作为内标能够校准基底组装不均匀导致的信号差别，提高分析方法的重现性。本方法实现了血清中6-TG的快速准确定量分析，分析速度快、灵敏度高、应用场景丰富，为6-TG的相关研究提供了新方法，也为6-TG在癌症治疗中的用药方案优化提供了可靠的工具。

图1金纳米星（AuNSs）基底制备方法和6-硫鸟嘌呤（6-TG）快速定量

AA:抗坏血酸（Ascorbic acid）;BSPP:二水合双（对磺酰苯基）苯基膦分子（Bis（P-sulfonatophenyl）phenylphosphine hydrate dipotassium salt）;SERS:表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy）

2、研究方法

L-抗坏血酸（分析纯）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane，APTES，分析纯）和鲱鱼精脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid from herring sperm，FSDNA）（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；二水合双（对磺酰苯基）苯基膦二钾盐和土霉素（化学纯，北京百灵威科技有限公司）；AgNO3（分析纯，永华化学有限公司）；无水乙醇（分析纯，湖州双林化学科技有限公司）；PBS缓冲剂（上海生工生物工程股份有限公司）；聚乙烯比咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP，国药集团化学试剂有限公司）；6-TG（分析纯，阿拉丁生化科技有限公司）；氧氟沙星（化学纯，美国药典）；氨苄青霉素钠、环丙沙星和NaOH（化学纯，阿拉丁生化科技有限公司）；盐酸恩诺沙星（化学纯，上海源叶生物科技有限公司）；葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；胆红素（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）。实验用水为去离子水。

仪器：如海光电SEED3000拉曼光谱仪（SEED3000目前已经升级为Portman便携拉曼光谱仪）

3、实验与结果分析

3.1 AuNSs的制备及结构表征

研究表明，等离激元纳米材料表面的局部电场在曲率较大处明显增强，因此，相比于表面光滑的纳米球（AuNPs），富含尖端和间隙的AuNSs通常表现出更强的LSPR性能，这是由于在特定波长光的照射下，AuNSs的分枝之间会产生等离激元偶合，从而大幅增加间隙位置的电磁场，使其具备更出色的拉曼信号增强能力。本研究根据文献报道的AuNSs合成方法并加以改进，以氯金酸为前驱体、抗坏血酸为还原剂，在球形金种子表面继续生长金，并在适当酸度条件下，调节Ag+的加入量，控制被还原的金生长成枝状结构，从而制备多尖端的AuNSs。本方法无需加入大量表面活性剂或聚合物，能够制备得到表面“干净”、结构可控的AuNSs（图2A~2D）。采用透射电子显微镜（TEM）测试了不同Ag+浓度合成的AuNSs的形貌，发现当Ag+浓度为0.5mmol/L时，得到的AuNSs的形貌更接近球形，只形成极少的分枝；随着Ag+浓度增加，AuNSs的尺寸逐渐增大，分枝数量也逐渐增多。当Ag+浓度为2mmol/L时，AuNSs的尺寸适中，并具有较多分枝。当Ag+浓度为3mmol/L时，AuNSs的尺寸过大，导致胶体稳定性明显降低。AuNSs的形貌对其LSPR性能具有较大影响，消光光谱的测试结果见图2E，可见随着Ag+浓度增加，制得的AuNSs光谱逐渐红移，最大吸收峰位置由543nm逐渐红移至815nm，并且峰强度逐渐增加。这是因为随着Ag+加入量增加，纳米星的尺寸逐渐增大且分枝逐渐增多，分枝之间的等离激元偶合随之增强，从而导致其光散射能力增加及散射光波长明显红移。由于枝状结构增加，AuNSs的结构差异性增大，光谱逐渐展宽。随着Ag+的加入量增加，AuNSs胶体溶液的颜色由紫色逐渐转变为深蓝色。上述结果表明，可以通过改变Ag+的浓度对AuNSs的形貌进行连续调控，且与其形貌和LSPR性能密切相关。

附了极少量的抗坏血酸以维持其胶体稳定性，在离心洗涤的采用Ag+调控法制得的AuNSs表面只吸过程中很容易不可控地聚集。为提高AuNS的稳定性，分别选择BSPP、PVP和FSDNA作为AuNSs的配体保护剂。如图3所示，PVP和FSDNA保护的AuNSs胶体溶液放置过夜后颜色变浅，消光光谱的强度明显降低，说明AuNSs发生了部分聚集。采用BSPP保护剂制得的AuNSs光谱的变化很小，离心后依配位能力很强，能够稳定结合在AuNSs表面，增加其表面电然保持很好的稳定性，说明BSPP中三价磷的荷，从而明显提高其胶体稳定性。后续实验用1 mg/mL BSPP作为AuNSs保护剂。

图2（A~D）分别采用0.5、1.0、2.0和3.0mmol/LAg+制备的AuNSs的透射电镜（TEM）图像；（E）对应的消光光谱图，a~d分别代表Ag+浓度为0.5、1.0、2.0和3.0mmol/L，插图为对应的AuNS体溶液的照片

图3 AuNSs保护剂的优化：AuNSs与（A）BSPP、（B）聚乙烯比咯烷酮（PVP）和（C）鲱鱼精脱氧核糖核酸（FSDNA）孵育后的胶体溶液的照片；（D~F）对应胶体溶液的消光光谱图

3.2 AuNSs的SERS活性研究

利用滴涂法，将制备的AuNSs-BSPP滴加在APTES活化的硅片上，得到SERS增强基底。在AuNSs BSPP基底的SERS谱图中，998、1028、1089和1582cm–1处出现了明显的拉曼信号（图4A），对应于BSPP分子的拉曼峰，且与BSPP固体粉末的拉曼谱图出峰位置一一对应，进一步验证了这些信号的来源。重要的是，这些拉曼信号并不会干扰6-TG的测定；在AuNSs-BSPP基底上滴加0.1mmol/L6-TG进行SERS测定，发现在915和1295cm‒1处出现了新的信号峰，对应于6-TG的拉曼信号。上述结果表明，BSPP在SERS基底制备中既可以提高AuNSs的稳定性，又能作为内标分子提高6-TG定量分析结果的重现性。6-TG分子中具有巯基基团，因此分子在AuNSs表面有较强的吸附能力。6-TG的加入会剥离部分结合在AuNSs表面的BSPP，导致其信号减弱。基于这一特征，以BSPP分子在1089cm‒1处的峰作为内标信号，利用6-TG在915cm‒1处的信号和内标信号的比值进行6-TG的定量分析。为验证比率法能否提高分析结果的重现性，在制备的AuNSs-BSPP基底上滴加6-TG分子，测试了基底表面20个随机位置的SERS谱图。采用915cm‒1处的单一信号强度以及915与1089cm‒1处的信号强度的比值分别绘制柱状图，并计算测试结果的RSD。结果表明，比率法能够明显提高分析结果的重现性，RSD由10.8%降低至4.5%（图4B~4D）。本研究设计的比率型AuNSs-BSPP基底能够避免基底组装时引入的不均匀性，保证了定量分析结果的重现性。同时，BSPP作为内标分子，与基底的作用力适中，在加入6-TG后，能够可控地部分脱落，释放活性位点以结合6-TG，保证了分析方法的灵敏度。为进一步提高AuNSs-BSPP基底在6-TG分析中的灵敏度，通过调控Ag+的浓度制得4种不同形貌的AuNSs，分别组装SERS基底，进行SERS测试（图4E和4F）。结果表明，6-TG和内标BSPP的信号比值随着Ag+浓度增大而增大，在采用2.0mmol/LAg+制备的基底上二者的信号比值最大。因此，综合考虑枝状结构数量、胶体稳定性和检测灵敏度等因素，选择2.0mmol/L Ag+制备的SERS基底进行后续研究。

图3内标型AuNSs-BSPP基底的SERS活性测试：（A）6-TG和BSPP分子在有/无基底增强时的拉曼光谱图；（B）1mmol/L6-TG分子在AuNSs-BSPP基底上孵育后，随机选取的20个位置点的拉曼光谱图；（C）915 cm‒1处SERS强度柱状图；（D）915和1089cm‒1处的SERS信号比值柱状图；（E）1mmol/L6-TG与不同Ag+添加量制备的SERS基底孵育后的SERS光谱图；（F）图4E中对应信号比值柱状图

3.3 AuNSs-BSPP基底的制备及条件优化

基底制备条件会显著改变纳米颗粒的密度和排布情况，对SERS活性产生影响。因此，对SERS基底制备时滴涂的AuNSs-BSPP浓度和次数进行了优化（图5）。采用浓缩500倍的AuNSs胶体溶液作为基准，分别稀释2和3倍，用于制备SERS基底，并进行光谱测试。结果表明，随着稀释倍数增大，基底的SERS活性逐渐减弱（图5A）。为验证增加AuNSs用量能否继续提高基底的SERS活性，采用未稀释的AuNSs经过多次滴涂制备基底（图5B），发现增加滴涂次数反而使SERS信号减弱。因此，选择浓缩500倍的AuNSs作为制备SERS基底的最佳浓度。采用扫描电子显微镜（SEM）对最优条件下制备的AuNSs BSPP基底进行表征，如图5C所示，AuNSs高密度排列在硅片上，AuNSs-BSPP基底结构均匀，非常适合后续的定量分析。

图4 1%柠檬酸钠溶液用量为0.6、1.0mL时制备的金纳米溶胶的FESEM图

3.4 6-TG检测条件的优化

将样品溶液滴加在AuNSs-BSPP基底上进行SERS分析时，6-TG能否吸附在基底表面对测试结果具有较大影响。6-TG的吸附时间和样品溶液的pH值都会影响6-TG的吸附效果，因此，对这两个条件进行了优化。如图6所示，随着吸附时间延长，6-TG与BSPP信号峰的比值（I6-TG/IBSPP）逐渐增大，但80min后，I6-TG/IBSPP趋向平稳，100 min时I6-TG/IBSPP最高。因此，选择最优吸附时间为100min。样品溶液的pH值会改变6-TG的结构共振形式，进而影响6-TG和AuNSs-BSPP基底的亲和力。采用磷酸盐缓冲液（PBS）调控样品溶液的pH值，在pH=7.4时，I6-TG/IBSPP达到最高值。因此，后续6-TG定量分析选择在吸附时间100min、样品溶液pH=7.4的条件下进行。

图6 6-TG检测条件的优化：（A）6-TG在基底上吸附不同时间后的SERS图和（B）对应的信号强度图；（C）在不同pH条件下测得的样品溶液的SERS图和（D）对应的信号强度图

在最优条件下，将不同浓度的6-TG滴加到AuNSs-BSPP基底上，进行SERS测试（图7）。以915和1089 cm‒1处6-TG和BSPP的特征SERS信号强度比值（I6-TG/IBSPP）为纵坐标、6-TG的浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。如图7B所示，在1.0×10-4~1.0mmol/L浓度范围内，6-TG浓度的对数值与I6-TG/IBSPP呈良好的线性关系（R2=0.99616），检出限（LOD=3σ/S，其中，σ为空白溶液响应信号的标准偏差，S表示线性校准曲线的斜率）为2.3×10–5mmol/L。本研究开发的比率型SERS基底检测6-TG的线性范围和LOD与文献报道的SERS分析法基本一致，并且分析结果重现性良好，可用于血清中6-TG的定量分析。

图7（A）不同浓度6-TG在AuNSs-BSPP基底上测得的SERS谱图；（B）对应的比率型信号和6-TG浓度的对数之间的线性关系

为了验证AuNSs-BSPP基底用于6-TG比率型SERS分析的特异性，选择5种抗生素药物（盐酸恩诺沙星、土霉素、环丙沙星、氧氟沙星和氨苄青霉素钠）作为干扰物质，检测AuNSs-BSPP基底对不同物质的响应（图8），其中，6-TG浓度为0.01mmol/L，各干扰物浓度为0.1mmol/L。结果表明，只检出915 cm‒1处6-TG的SERS信号，表明本方法用于6-TG检测具有较高的特异性。为了进一步验证血清中存在的物质是否干扰6-TG检测，分别将胆红素、葡萄糖和健康人血清滴加在AuNSs-BSPP基底上进行SERS测试，结果表明，这些物质未产生干扰信号。这主要是因为BSPP和AuNSs的亲和力适当，既能有效抑制血清中干扰物质在基底上的吸附，又不干扰6-TG的吸附，保证了本方法的特异性。同时，SERS法的分辨率高，可识别6-TG的特征峰，其它干扰物质不影响测定结果。因此，本方法可在不对样品进行复杂的前处理条件下，实现血清中6-TG的快速分析。

图8（A）不同干扰物在AuNSs-BSPP基底上的SERS谱图；（B）不同干扰物质的SERS信号。a~i分别为6-TG（0.01 mmol/L）、氨苄青霉素钠（0.1mmol/L）、氧氟沙星（0.1mmol/L）、环丙沙星（0.1mmol/L）、土霉素（0.1mmol/L）、盐酸恩诺沙星（0.1mmol/L）、葡萄糖（6.1mmol/L）、胆红素（17μmol/L）和人血清

3.5血清中6-TG含量的测定

在健康人血清样品中加入不同浓度的6-TG，然后滴加在AuNSs-BSPP基底上进行SERS测试，结果见图9和表1。结果表明，利用此比率型SERS分析法定量分析血清中的6-TG时具有较高的重现性（RSD<5.32%，n=3），加标回收率在94%~104%之间，表明本方法能够用于成分复杂的血清中6-TG的准确定量分析。

图9在血清样品中加入不同浓度的6-TG后测得的SERS谱图

表1血清中6-TG的测定结果

4、结论

建立了一种基于多尖端AuNSs的SERS比率型定量分析方法，能够快速、准确地检测血清中的6-TG浓度。通过调控AuNSs的合成方法，制备出具有独特多尖端结构的AuNSs，这些尖端结构能够显著增强拉曼散射信号，极大地提升了SERS的灵敏度。同时，选用BSPP作为配体分子，既能提高AuNSs的稳定性，又能作为内标分子辅助6-TG的定量分析。本方法具有高灵敏度、高选择性、非侵入性和便携性等优点，为6-TG的用药监测提供了可靠方法。在待测分子和基底的亲和力强于BSPP，且共存干扰物的亲和力弱于BSPP，或干扰物在目标分子拉曼信号的出峰位置无干扰的条件下，本方法能实现对6-TG特异性检测。此外，对于满足上述条件并且信号互不干扰的多种物质，本方法还能够实现多目标分子的同时检测，有望为药物代谢动力学研究提供可靠的方法。

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产品介绍

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