从猪肠黏膜到生物反应器：合成生物学如何重塑百年抗凝药的生产逻辑？

做过糖生物学相关课题的人，大概都有过这种体验：当你在组会上提到 "我在做肝素相关的工作"，台下总会有老师追问一句 ——"那你们最后还是从猪肠子里面提吗？"

这个问题听起来有点朴素，但它戳中了一个困扰了制药行业几十年的现实：作为全球用量最大的抗凝药物，肝素从发现至今快 110 年了，它的主要生产方式竟然没有发生根本性变化。

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直到最近几年，合成生物学的进展才让这件事出现了真正的转机。

今天这篇综述，是浙江大学与中科院微生物所团队2026年1月刚发表在Bioresources and Bioprocessing上的一篇系统综述，把肝素生物制造的两条技术路线、关键技术节点、当前进展和未来瓶颈梳理得相当清楚。我通读了一遍，觉得对做糖工程、代谢工程或者关注生物药供应链的同学来说，值得认真读一读。

下面我按自己的理解，把这篇综述的核心逻辑拆成几个部分来讲。

01 先搞清楚一个问题：百年肝素为什么突然 "不够用" 了？

肝素不是什么新概念。它是一种高度硫酸化的糖胺聚糖（GAG），主要从猪肠黏膜中提取，临床上用于血液透析、心脏搭桥手术、深静脉血栓预防等场景，是世界卫生组织列的基本药物之一。

按分子量分，它有三个规格：普通肝素（UFH，3-30 kDa）、低分子肝素（LMWH，~1-10 kDa）和超低分子肝素（ULMWH，<3 kDa）。临床用量最大的是低分子肝素，比如我们熟悉的那屈肝素、依诺肝素。

过去几十年，行业里不是没有人想过替代动物源提取，但一直动力不足。直到 2018 年非洲猪瘟暴发。

根据综述里的数据，2018 年之后中国生猪存栏量下降了约 5 亿头，直接导致全球肝素原料供应减少了超过 80 吨。2019 年新冠疫情又进一步打乱了供应链，原料价格短期上涨了 20%-35%。而到 2025 年，全球肝素市场规模预计达到约 62.1 亿美元。

这件事暴露了一个根本性的脆弱性：一个年需求量以吨计的关键药物，它的原料竟然高度依赖一个农业产业 —— 而且这个产业还受动物疫病的直接影响。

除了供应链风险，动物源肝素还有两个长期被诟病的问题：

一是病原传播风险。虽然现代提取工艺已经很成熟，但动物源原料天然携带病毒、朊蛋白等病原体的可能性始终存在，这也是监管机构一直盯着的方向。

二是批间差异。不同批次猪肠黏膜的肝素含量、分子量分布、硫酸化程度都不一样，药厂需要做大量后续纯化和质控，才能保证每一批产品符合药典标准。

这就是生物工程肝素的出发点。不是为了 "用合成生物学炫技"，而是产业确实需要一个更稳定、更安全、更可控的替代方案。

02 最可行的路径：先造 "骨架"，再 "穿衣服"

目前走得最远、也最接近产业化的路线，是微生物发酵 + 化学酶法修饰的组合策略。

这个思路其实很朴素：既然完整的肝素结构太复杂，我们不直接做全合成，而是先让微生物帮我们合成一个 "简化版骨架"——heparosan（肝素前体多糖），然后再用酶促反应，一步一步把硫酸基团加上去，模拟出天然肝素的结构。

图1：不同肝素生产策略的示意图。上方是天然肝素的提取路径，下方左侧是 "体内/体外组合策略"（微生物发酵 heparosan + 磺基转移酶修饰），下方右侧是从头生物合成。

微生物怎么造出 heparosan？

自然界里，有些细菌本身就会合成 heparosan—— 比如大肠杆菌 K5（E. coli K5）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）。它们用这个多糖做荚膜，保护自己不被宿主免疫系统攻击。

科学家要做的，就是把这个 "天然能力" 放大、优化，变成一个可控的工业发酵过程。

图2：微生物合成 heparosan 的代谢途径示意图。从葡萄糖出发，经过糖酵解途径生成 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 两个前体，再由聚合酶组装成 heparosan 链。

综述里把代谢工程的策略分成了四个方向，我觉得这个分类挺清晰的：

第一，途径重编程，提高碳通量。就是把微生物的代谢流尽量往 heparosan 合成的方向引导。比如在大肠杆菌 K5 里高表达 kfiA/B/C/D 和 PmHS2，配合伴侣蛋白，产量能到 1.5 g/L。再进一步敲除竞争途径、过表达调控因子，最高能做到 1.40-7.02 g/L。

第二，精准调控 UDP - 糖前体比例。heparosan 的合成需要两个前体：UDP - 葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）和 UDP-N - 乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）。这两个前体的比例直接影响聚合效率和分子量分布。研究发现，同时过表达两个前体的合成途径基因，产量能从原来的瓶颈里突破出来，比如在谷氨酸棒杆菌里做到 1.96 g/L，平均分子量 41.90 kDa。

第三，聚合与转运的协同优化。这个很关键。如果 heparosan 都堆在细胞里面，积累多了会反馈抑制，产量上不去。科学家把聚合酶和转运蛋白一起做了染色体上的扩增，把 heparosan 直接分泌到胞外，产量能到 9.10 g/L—— 这是目前我看到的最高水平。

第四，模块化聚合酶工程。把聚合酶拆成不同模块，组合出不同长度、不同分子量分布的 heparosan 骨架，方便后续做不同规格的肝素产品。

表1里列了目前已经报道的几十种工程化菌株的产量数据，从摇瓶水平到发酵罐水平都有。感兴趣的同学可以去看原文，数据量很大，我这里就不一一搬运了。

表1 肝素前体的微生物合成策略

有了骨架之后呢？五步酶法 "穿衣服"

heparosan 只是一个没有硫酸基团的 "裸多糖"，它没有抗凝活性。要变成肝素，还需要做一系列的翻译后修饰 —— 就像给骨架 "穿衣服"。

这个过程需要五种关键酶依次工作：

图3：肝素化修饰和体外 PAPS 再生的示意图。A：五种磺基转移酶及其作用位点；B：从 heparosan 到肝素的多步酶法修饰流程；C-D：PAPS 再生系统的化学与酶法路径。

这五步分别是：

• N -脱乙酰酶/N-磺基转移酶（NDST）：先把 N - 乙酰基脱掉，再加上 N - 硫酸基团。这是整个修饰过程的第一步，也是最关键的一步。

• C5 差向异构酶（C5epi）：把葡萄糖醛酸（GlcA）差向异构化成艾杜糖醛酸（IdoA）。这一步决定了肝素链的柔性，对后续硫酸化和活性都很重要。

• 2-O-磺基转移酶（2OST）：在艾杜糖醛酸的 2 位羟基上加硫酸基团。

• 6-O-磺基转移酶（6OST）：在葡糖胺的 6 位羟基上加硫酸基团。

• 3-O-磺基转移酶（3OST）：在葡糖胺的 3 位羟基上加硫酸基团。这一步最特殊 —— 只有加上了 3-O - 硫酸基团，肝素才能结合抗凝血酶 III，产生真正的抗凝活性。

听起来好像就是五步反应，但实际操作起来，每一步都是坑。

比如 NDST，这个酶非常难表达，重组活性一直上不去。科学家做了蛋白工程改造，把它的磺基转移酶结构域单独拿出来优化，活性提升了上百倍，但距离工业化的要求还是有差距。

再比如 PAPS（3'- 磷酸腺苷 - 5'- 磷酸硫酸），它是所有磺基转移酶的 "硫酸基团供体"。没有 PAPS，所有磺基转移酶都没法工作。但 PAPS 本身非常贵，而且不稳定。怎么在反应体系里持续再生 PAPS，是整个化学酶法路线成本控制的核心问题。

综述里专门用了很大篇幅讲 PAPS 再生系统，目前主要有两种思路：

• ATP 依赖型级联系统：用 ATP 硫酸盐化酶和 APS 激酶，从 ATP 出发合成 PAPS。优点是成熟，缺点是 ATP 成本高，而且会反馈抑制。

• PPK 依赖型酶法再生：用多聚磷酸激酶（PPK），把副产物 ADP 重新磷酸化回 ATP，形成一个闭环。这个思路更新，成本更低，也是目前研究的热点方向。

除此之外，还有一釜法合成（one-pot synthesis）、酶固定化等工程化策略，都是为了把多步反应整合起来，降低成本，提高规模化的可能性。

03 最前沿的探索：从葡萄糖到完整肝素的 "一步到位"

如果说 "发酵 + 酶法修饰" 是两步走的务实路线，那从头生物合成（de novo biosynthesis）就是更有野心的一步到位方案 —— 直接让一个细胞从葡萄糖开始，一路合成出完整的、有活性的肝素。

图 4：从头肝素生物合成和体内 PAPS 供应的示意图。展示了在真核细胞中重建完整的肝素合成途径，包括四糖连接区、聚合酶、五种修饰酶以及胞内 PAPS 再生系统。

这条路线目前主要在两类宿主里探索：

第一类是哺乳动物细胞。比如 CHO 细胞、HEK293 细胞、肥大细胞。道理很简单 —— 哺乳动物细胞本身就有合成糖胺聚糖的全套机器，我们只需要把肝素合成相关的基因导进去，让它 "改做" 肝素就行了。

综述里提到，Thacker 团队在肥大细胞里过表达了3OST-1、6OST-1、6OST-2、NDST-2，同时敲除了软骨素合成相关的基因，最终得到的细胞株能产生抗凝活性超过药用标准的肝素。这个工作我之前也读过，确实是从头合成路线里一个里程碑式的进展。

但哺乳动物细胞路线的问题也很明显：培养成本高、产量低、放大困难。从产业化角度看，短期内不太现实。

第二类是微生物，特别是毕赤酵母（Pichia pastoris）。这是目前最被看好的从头合成宿主。

毕赤酵母是一个已经被 FDA 认定为 GRAS（一般认为安全）的工业用宿主，常用在重组蛋白生产上。它的优势是：培养密度高、翻译后修饰能力强、适合高密度发酵。

Li 等人在毕赤酵母里导入了完整的肝素合成途径 —— 包括双功能的 NDST、C5epi、2OST、6OST、3OST，还有四糖连接区所需的糖基转移酶。最终在 3-L 发酵罐里做到了 2.08 g/L 的生物工程肝素。

这个产量虽然还远低于动物源提取的成本水平，但它证明了一件事：从简单碳源到完整肝素，这条路径在微生物里是走得通的。

不过从头合成路线有一个核心瓶颈，综述里反复强调，我觉得也是整个领域目前最大的卡点：PAPS 的胞内供应。

PAPS 是硫酸基团的活性供体，所有磺基转移酶都要用它。但大多数微生物（包括大肠杆菌和毕赤酵母）天然合成 PAPS 的能力非常弱。你把五种磺基转移酶都导进去了，但细胞里没有足够的 PAPS，这些酶就是 "巧妇难为无米之炊"。

所以最近几年，大家都在想办法强化胞内 PAPS 的合成：过表达 ATP 硫酸盐化酶（ATPS）和 APS 激酶（APSK）、强化多聚磷酸代谢途径、敲除 PAPS 降解酶…… 这些策略确实能把 PAPS 浓度提上来，但距离满足大规模硫酸化的需求，还差得远。

04 三条路放在一起看：谁更可能先走到产业化？

综述最后用一张表，把三种肝素生产策略做了系统对比。我觉得这张表是整篇综述里最值得细看的部分之一。

表2：三种生物工程肝素生产策略的对比。

如果让我自己做一个判断 ——

最有可能先走到大规模临床应用的，不是从头合成，而是 "微生物发酵 heparosan + 化学酶法修饰" 的组合路线。

理由很简单：

第一，这条路线的上游发酵部分已经相当成熟了。9.10 g/L 的 heparosan 产量，放在代谢工程领域里不算差，发酵放大的工程问题相对好解决。

第二，化学酶法修饰的每一步，单独拿出来都已经有了相当的研究基础。虽然五步串联起来做还很复杂，但它的 "模块化" 程度高 —— 每一步都可以单独优化，不需要像从头合成那样，把所有变量放在一个细胞里同时解决。

第三，监管路径相对清晰。美国 FDA 已经有了动物源肝素的完整药典标准，生物工程肝素只需要证明它和药典肝素在结构、活性、药代动力学上等效，就有机会走 505 (b)(2) 的申报路径。而从头合成的产品，结构完全是新的，监管上要走的路要长得多。

但这条路线也不是没有问题。综述里特别指出，多步硫酸化反应的规模化放大是个大难题 —— 酶成本高、反应时间长、收率低，这些都是在实验室里容易解决、到了工业生产上就变成致命问题的事情。

05 冷静看距离：从实验室到患者，还有几道坎？

最后，我想稍微 "泼点冷水"，聊一下这篇综述里提到的、但经常被乐观报道忽略的几个现实问题。

第一，结构复杂性的问题。肝素不是一个单一分子，而是一组分子量不同、硫酸化程度不同、序列也不同的混合物。即使你用酶法做出来了，怎么证明它和药典肝素 "质量一致"？怎么表征那几十种不同的二糖单元？这些分析方法学本身就是一个大工程。

综述里提到，多维 NMR 和 LC-MS 二糖图谱分析是目前最主要的表征手段。但要把这些方法变成药典级别的质控标准，还需要大量的工作。

第二，免疫原性的问题。重组表达的磺基转移酶、宿主细胞残留蛋白、内毒素…… 这些杂质都可能引发免疫反应。虽然体外试验看起来没问题，但动物实验和临床试验里会不会出问题，谁也不敢打包票。综述里也提到，全面的免疫原性评估 —— 包括补体激活、血小板因子 4 结合、白细胞募集 —— 是临床前研究里必须做透的事情。

第三，成本的问题。这是最现实的。动物源肝素之所以用了几十年，很大程度上是因为它便宜 —— 猪肠黏膜是肉制品工业的副产物，原料成本极低。生物工程肝素要在成本上和它竞争，不是一件容易的事。

当然，从另一个角度看，随着酶工程、PAPS 再生系统、连续生物加工这些技术不断进步，成本下降的空间是很大的。只是这个过程需要时间，不是三五年就能完成的。

第四，监管路径的问题。生物工程肝素要上市，需要证明它和动物源肝素的生物等效性。但肝素本身就是一个混合物，怎么定义 "等效"？是活性等效？结构等效？还是临床结局等效？这些问题都需要监管机构和行业一起协商。

读完这篇综述，我最大的感受是：合成生物学在糖工程领域的应用，正在从 "概念验证" 走向 "工程化落地" 的关键阶段。

十年前，大家讨论肝素生物制造，更多是在说 "这在原理上是可行的"。十年后的今天，我们已经有了克级产量的heparosan、有了能产肝素的重组毕赤酵母、有了 PAPS 再生的闭环系统。这些进展单独拿出来看，好像都还差一口气，但放在一起，方向已经很清楚了。

当然，从 "实验室能做出来" 到 "病人能用上"，中间还有很长的路要走。结构表征、免疫原性、成本控制、监管路径 —— 每一个都是硬骨头。

但至少，我们已经从 "猪肠黏膜里提" 这一条路上，看到了第二个、第三个选项。对于一个年需求量以吨计、关系到全球数百万患者手术安全的关键药物来说，这本身就是一件值得认真对待的事。

文献来源：Pan Y, Liu Z, Wang P, et al. Synthetic biology for heparin biomanufacturing. Bioresources and Bioprocessing. 2026;13:9. DOI: 10.1186/s40643-025-00999-x

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