Cell | 光控Cas12f系统结合聚焦超声，实现体内基因编辑的无创时空调控

撰文|木兰之枻

CRISPR-Cas基因编辑系统的体内应用长期受限于编辑工具持续表达和活化导致的脱靶风险增加。因此，以无创的方式实现体内基因编辑的精准时空调控，对于提升基因编辑安全性并推动未来临床转化至关重要。光遗传学为这一目标的实现提供了潜在思路：通过光敏蛋白调节Cas核酸酶活性，有望实现基因编辑的无创时空调控【1】。虽然光控基因编辑系统在细胞水平得到了验证，其体内应用仍面临有效递送与无创调控等多重挑战。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是实现基因编辑工具体内高效安全递送的重要载体，但其包装容量有限（约4.7 kb）；难以通过单AAV系统实现经典Cas蛋白及光控元件的有效递送。与此同时，可见光的组织穿透能力有限，制约了其对深部组织的有效调控，而植入光纤或发光器件则难以满足无创干预的需求。近年来，Cas12f为代表的微型基因编辑系统为单AAV体内递送奠定了基础【2】；而可将聚焦超声（focused ultrasound，FUS）转化为局部光信号的机械发光材料则为深部组织的无创光调控提供了新的思路【3】。

近日，斯坦福大学的Michael Z. Lin与Guosong Hong团队合作在Cell杂志发表题为Non-invasive control of gene editing in vivo by photoswitchable Cas12f and focused ultrasound 的论文。文章通过构建适配单AAV递送系统的光控Cas12f（psCas12f）系统，并结合聚焦超声FUS与机械发光材料MLNTs介导的局部光信号转换，最终在小鼠多器官中实现了基因编辑的无创时空特异性激活，从而为基因编辑的体内应用提供了新的解决方案。

研究者首先基于Cas12f突变体CasMINI的二聚体结构设计光控开关。CasMINI以二聚体形式与单条向导RNA（sgRNA）组装形成功能复合物，这是识别并结合靶DNA的基础。荧光蛋白 pdDronpa具有光响应二聚化特性，因此在CasMINI蛋白N端融合pdDronpa时，可借助该 特性实现CasMINI活性的精准调控：无光条件下，pdDronpa可稳定形成二聚体，通过空间位阻阻断CasMINI-sgRNA复合物对靶DNA的识别与结合，系统处于关闭状态；经500 nm青光照射后，pdDronpa二聚体解离，空间位阻消除，CasMINI可结合并编辑靶位点DNA，最终实现基因编辑的活性调控。通过优化pdDronpa与CasMINI之间的连接肽，研究者开发出初代光控基因编辑工具psCasMINI。在HEK293T细胞的VEGFA位点，psCasMINI在光照前的基因编辑活性约为0.2%，接近本底水平；光照后约为8.9%，与野生型CasMINI活性相当。此外，psCasMINI系统大小为779个氨基酸，编码序列约2.3 kb，可通过单AAV系统实现体内的有效递送。

随后，为验证单AAV适配的在体无创光控编辑，研究者选择LSL-AkaLuc转基因报告小鼠开展相关研究，该小鼠在目标位点发生基因编辑后可启动AkaLuc荧光素酶表达，并在给予底物AkaLumine-HCl后产生生物发光信号。研究者采用高肌肉亲和性的AAV9系统递送psCasMINI及sgRNA，在胫骨前肌进行肌内注射后14天进行光照及生物发光强度分析。结果显示，无光照条件下psCasMINI组内小鼠的生物发光信号比野生CasMINI组低14.9倍，表明其背景活性较低。经4天外部青光照射后， psCasMINI组小鼠的生物发光信号增强约11倍，已接近野生CasMINI组的水平。研究者还将无线LED光照设备通过皮下植入的方式依次置于左右侧肌肉上方（避免设备被小鼠移除），之后在不同时间点分别照射两侧肌肉，最终可成功激活不同部位的生物发光信号，证实了psCasMINI系统实现体内基因编辑时空特异性调控的可行性。

尽管外部光照可实现肌肉等浅表组织内基因编辑的无创调控，但要实现深部组织的精准调控常依赖侵入性操作。针对上述技术瓶颈，研究者提出将机械发光纳米换能材料（mechanoluminescent nanotransducers,MLNTs，如铝酸锶发光材料 SAO）与聚焦超声FUS相结合的策略，以期在无创条件下实现psCasMINI基因编辑的时空特异性调控。该策略的核心原理为：血管注射的SAO材料可随血液循环分布至全身；当聚焦超声靶向作用于特定区域时，产生的机械应力可激发SAO跃迁至高能态，进而发射波长约 500 nm 的青光，最终实现psCasMINI的时空特异性激活。为验证 FUS -MLNTs系统激活psCasMINI实现基因编辑无创特异性调控的可行性，研究者 仍以LSL-AkaLuc报告小鼠的胫骨前肌为对象开展实验验证。在第一代方案中，经4轮MLNT给药、超声刺激及用于为MLNT补充能量的紫外照射后，小鼠肌肉内生物发光信号较本底提升约13倍；而在无MLNT的对照组中，单纯超声刺激无法激活psCasMINI系统。研究者进一步向小鼠双侧下肢注射AAV9病毒，并联合MLNT-FUS系统分别刺激不同小鼠的左右腿，最终实现了生物发光信号的时空特异性激活。不过现有的MLNT-FUS策略仍存在明显局限：一方面操作流程繁杂，需要多轮次MLNT注射与FUS超声刺激，且需通过腹部紫外照射为循环中的MLNT补充能量；另一方面，反复注射与紫外照射易诱发额外的生理应激反应。

针对以上局限，研究者尝试从核酸酶元件与光敏调控元件两方面进行优化：一方面将初代系统中的CasMINI替换为编辑活性更高的eCas12f1与AsCas12f-HKRA变体；另一方面对光敏元件pdDronpa进行定点改造而构建出光响应性能更优的pdDronpa2，最终开发出第二代光控微型基因编辑工具ps2-Cas12f。初步分析结果显示，相同光照条件下，第二代ps2-Cas12f的光诱导编辑响应强度是初代ps1-CasMINI的19倍。在LSL-AkaLuc报告小鼠的胫骨前肌生物发光实验中，ps2-Cas12f的激活效果同样显著优于ps1-CasMINI。靶向测序结果显示，小鼠肌肉靶位点经外部光照后，ps2-eCas12f1介导的基因编辑效率可达47.2%，而ps2-CasMINI与ps2-AsCas12f-HKRA的编辑效率低于22%；在无光条件下，系统本底编辑效率仅为1.5%，这证实了新系统在体内的高编辑效率与光控特异性。此外，第二代ps2-Cas12f系统的体内操作流程得到了大幅简化：无需额外的体内紫外照射，单次MLNT给药联合15分钟聚焦超声刺激即可在报告小鼠肌肉中实现高效的生物发光激活，且激活效果显著优于初代系统经四轮MLNT-FUS刺激后的水平。

为探索该系统在脑内实现时空特异性基因编辑调控的效果，研究者选用可穿透小鼠血脑屏障的AAV-CAP.B10血清型递送psCasMINI系统，并分别采用外部光照与MLNT-FUS两种刺激模式，系统评估脑内基因编辑的激活效率与时空调控精度。外部光照结果显示，该方式可有效激活脑内编辑：其中ps1-CasMINI的生物发光信号强度较本底水平提升4.6倍，活性约为野生型CasMINI的1/3；ps2-CasMINI的生物发光信号强度较本底水平提升12.6倍，活性已接近野生型CasMINI，激活性能显著优于初代系统。MLNT-FUS刺激进一步验证了系统的无创精准调控能力：单次MLNT给药后，将聚焦超声靶向作用于小鼠右侧脑区，ps2-CasMINI可在靶区产生明显的局部生物发光信号；而同等条件下，第一代ps1-CasMINI未检测到显著的生物发光激活。在此基础上，研究者对同一只小鼠的左右脑区开展分时超声刺激，成功实现了不同脑区生物发光信号的顺序激活，证实了该系统的时空特异性调控特性。

为进一步验证该系统对内源基因的时空特异性编辑能力，研究者以小鼠肝脏TTR基因为靶点开展系统验证。研究者首先在细胞层面测试了ps1/2-Cas12f系统靶向编辑TTR基因的活性与特异性，证实了光控基因编辑系统的高编辑活性和与靶向特异性。随后的体内实验中，研究者选用肝脏高亲和性的AAV8血清型病毒，以肝脏特异性启动子驱动 ps1/2-Cas12f系统表达，之后分别在AAV注射后第4-5周对小鼠施加外部光照或MLNT-FUS刺激，通过检测血浆TTR蛋白水平评估体内干预效果，并在第8周通过靶向测序对肝脏组织的TTR基因编辑效率进行分析。实验结果显示：施加外部刺激前，ps1/2-Cas12f组小鼠的血浆TTR蛋白水平均无明显改变；经光照或超声刺激后，小鼠血浆TTR蛋白水平均出现明显下降，其中ps2-AsCas12f-HKRA组在两种刺激方式下的TTR蛋白下调幅度均最为显著。肝脏组织靶向测序结果进一步证实了蛋白水平的变化：经外部光照刺激后，ps2-AsCas12f-HKRA组小鼠肝脏TTR位点的编辑效率最高，可达 38%~54%；MLNT-FUS刺激同样可诱导内源TTR基因编辑，但整体编辑效率低于直接光照，这可能与超声激活的空间范围更具局限性相关。

在特异性与安全性层面，体内实验结果表明：外部光照与MLNT-FUS刺激均未引发明显肝脏毒性，小鼠血清AST、ALT水平无明显变化，组织分析也未观察到明显组织损伤、神经元丢失或胶质细胞激活等病理改变，验证了该系统体内应用的安全性。

综上所述，本研究通过将微型Cas12f核酸酶与光控二聚体荧光蛋白pdDronpa整合，开发出光控型Cas12f基因编辑系统。该系统与聚焦超声介导的体内机械发光体系的进一步结合，建立了适配单AAV载体递送的时空可控基因编辑平台，在小鼠多种器官中实现了无创且时空特异性的基因编辑精准调控。该研究不仅为体内时空特异性基因编辑提供了全新工具，也为后续开展更精准安全的基因干预研究奠定了技术基础。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.09.005

制版人： 十一

参考文献

1. Zhou, X. X. et al. A Single-Chain Photoswitchable CRISPR-Cas9 Architecture for Light-Inducible Gene Editing and Transcription.ACS Chem. Biol.13, 443-448 (2018).

2. Xu, X. et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing.Mol. Cell81, 4333-4345.e4 (2021).

3. Wu, X. et al. Sono-optogenetics facilitated by a circulation-delivered rechargeable light source for minimally invasive optogenetics.Proc. Natl. Acad. Sci. USA116, 26332-26342 (2019).

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