Chinese Medicine-IF7.4：山东中医药大学第二附属医院揭示中药单体小檗碱如何调控肾小管糖重吸收发挥糖尿病肾脏保护作用

✍导语

小檗碱（黄连素）（BBR）是中药黄连的核心活性成分，据报道具有抗高血糖和肾脏保护作用，但小檗碱如何调控肾小管葡萄糖重吸收，分子靶标尚不清晰。一篇发表于Chinese Medicine（IF：7.4）的研究完整揭示：小檗碱通过FOXO1/SP1调控轴，下调肾脏SGLT-2表达，抑制肾小管葡萄糖重吸收，改善糖尿病肾损伤，为小檗碱治疗糖尿病肾病提供新机制证据。

PART 01

题目及作者信息

PART 02

️文献摘要：

一图概括

【目的】

探讨BBR是否通过调节SGLT-2表达来减轻糖尿病肾损伤，并考察FOXO1和SP1在这一调节中的潜在作用。

【方法】

使用Db/db小鼠和暴露于高葡萄糖的HK-2细胞来评估BBR、恩格列净（EM）及其联合用药的效果。通过生化、组织学和超微结构分析评估了代谢和肾脏表型。为了探究其调节机制，进行了网络药理学、公共转录组数据挖掘、分子对接、细胞热稳定性分析（CETSA）、定量实时PCR、Western Blot、免疫荧光、核质分离、共免疫沉淀、2-NBDG摄取、双荧光素酶报告基因实验、FOXO1过表达以及对SP1相关调控的药理学干扰。

【结果】

BBR和EM均改善了db/db小鼠的代谢异常和肾损伤，而联合治疗产生了显著的代谢和肾脏改善，但伴随着AST水平的上升趋势。BBR降低了高血糖，改善了葡萄糖耐量，增强了胰岛素耐量试验（ITT）期间对外源性胰岛素的降糖反应，抑制了尿白蛋白排泄，并缓解了肾脏的组织病理学和超微结构损伤。分子对接和定性CETSA结果表明，FOXO1可能是BBR的潜在分子靶点。在HK-2细胞中，高糖刺激增加了SGLT-2的表达和葡萄糖摄取，并伴随着FOXO1和SP1信号传导的失调。BBR下调了FOXO1和SGLT-2，恢复了SP1和磷酸化FOXO1的水平，并在高糖条件下减少了葡萄糖摄取。FOXO1过表达减轻了BBR诱导的SGLT-2表达降低，而对SP1相关调控的药理学干预进一步证实了SP1在SGLT-2调控中的功能参与。

【结论】
BBR至少部分是通过FOXO1/SP1相关调控肾脏SGLT-2表达来减轻糖尿病肾损伤的。这些发现支持FOXO1/SP1相关调控轴在糖尿病条件下肾小管葡萄糖处理中的作用。

PART 03

研究思路与方法

研究思路：体内+体外+生信+分子互作验证

网络药理生信预测→分子对接/CETSA验证靶标结合→动物体内药效表型→细胞表型→分子机制→基因过表达+药物抑制剂反向验证闭环

动物实验

·模型：db/db（2型糖尿病肥胖小鼠），db/m为对照；分组：模型组、恩格列净阳性对照组、小檗碱低/中/高剂量、小檗碱+恩格列净联合组；灌胃干预16周。

·检测：空腹血糖、OGTT、ITT、血脂；24h尿糖、尿白蛋白、肾功能指标；肾脏HE染色、透射电镜TEM；肾组织qPCR、免疫组化。

细胞实验

·细胞：人肾小管上皮HK-2细胞；高糖50mM造模；小檗碱10/20μM干预。

·检测：2-NBDG葡萄糖摄取实验；核质分离、WB、免疫荧光；Co-IP；双荧光素酶报告；FOXO1过表达慢病毒；SP1抑制剂Mithramycin A干预。

生信&分子互作

·网络药理学、GEO数据集（GSE26168、GSE30528）挖掘疾病差异基因；

·分子对接预测小檗碱与FOXO1结合；CETSA细胞热迁移实验验证小檗碱直接结合FOXO1蛋白。

PART 04

核心亮点✨

1. 机制创新：首次提出小檗碱通过FOXO1-SP1-SGLT-2转录调控轴调控肾脏近端小管葡萄糖重吸收，拓展小檗碱糖尿病肾病保护新机制，不再局限炎症、氧化应激。

2. 完整闭环逻辑：生信预测→分子对接CETSA提示靶标→体内药效→细胞表型→蛋白互作→过表达+抑制剂双向反向验证，做到中药单体机制干湿结合闭环。

3. 对比临床药物恩格列净：将中药单体与SGLT-2抑制剂平行对照，比较药效差异，同时提示联合用药潜在肝酶升高的安全隐患，具有临床转化提示意义。

PART 05

研究结果

图1：BBR改善db/db小鼠的代谢异常

A小檗碱（BBR）的化学结构。B实验设计的示意图。db/db小鼠从8周龄至24周龄接受载体、恩格列净（EM）、BBR或联合治疗，随后在牺牲前进行代谢表型分析。C, D干预期间随机血糖和体重动态变化。E, F口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。G, H终点随机血糖和体重定量。 I, J口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）曲线下面积（AUC）分析。K, L 血清脂质谱，包括总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。M血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。数据以平均值±SEM表示（每组n=8只小鼠）。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 vs db/db; <0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, ####P<0.0001 vs db/m。

图2：BBR改善db/db小鼠的肾功能障碍和肾组织病理损伤

A，B 不同组的尿量和尿糖排泄量。C，D 尿白蛋白排泄量（UAE）和尿肌酐排泄量（Ucr）。E–G 肾生化和滤过功能参数，包括血尿素氮（BUN）、血清肌酐（CREA）和肾小球滤过率（GFR）。H 肾重量/体重比（KW/BW）。I 各组肾脏组织病理学和超微结构改变的代表性图像。 a 肾脏切片的代表性H&E染色。 b 肾小球滤过屏障改变的TEM分析。 c 肾小管上皮细胞线粒体超微结构改变的TEM分析。 对于尿液和肾脏生化测量（A–H），每组n = 8只小鼠。代表性组织学图像取自每组5只小鼠。代表性TEM 图像取自每组n = 3只小鼠，每只小鼠检查多个视野。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001vs db/db; <0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, ####P<0.0001 vs db/m。

图3：生物信息学分析确定FOXO1和SLC5A2为糖尿病相关候选基因及更广泛的BBR相关信号通路

A GSE26168数据集中差异表达基因的火山图以及 FOXO1 在不同组中的表达水平。 B GSE30528数据集中差异表达基因的火山图以及 SLC5A2 在不同组中的表达水平。 C 贝叶斯网络预测靶点与糖尿病相关预测靶点重叠的维恩图。 D 共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。 E 共同靶点的基因本体（GO）富集分析。 F 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析的共同靶点。 G 分子对接模型显示BBR与FOXO1的结合模式。 H CETSA分析HK-2细胞中经DMSO或BBR处理的FOXO1热稳定性。细胞在指示温度（37–66 °C）下加热，并通过Western blot检测可溶性FOXO1。

图4：BBR部分逆转db/db小鼠中肾脏FOXO1/SP1/SGLT-2的失调

A不同组肾组织中p-FOXO1、FOXO1、SP1和SGLT-2的代表性免疫组化染色图像。B使用每组n=5只小鼠的肾切片进行免疫组化染色定量分析。对每只小鼠的三个不重叠视野进行分析，并将视野水平测量值取平均值，以获得每只小鼠的一个数值。C 肾组织qPCR分析采用每组n=3只小鼠进行。每个生物学样本均进行技术三联分析，并取技术重复值的平均值作为每只小鼠的一 个值。数据以平 均值±SEM表示。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001vsdb/d b;<0.0 5 ,#<0.01,##<0.001, ###<0.0001 vs db/m。

图5：BBR调节模型细胞中的葡萄糖摄取和FOXO1/SP1/SGLT-2轴

A 代表性2-NBDG荧光图像，显示对照组、模型组和BBR处理组细胞的葡萄糖摄取情况。 B 总细胞蛋白提取物中FOXO1、p-FOXO1、SP1和SGLT-2表达的Western blot分析。 C 核和细胞质组分中FOXO1、p-FOXO1和SP1表达的Western blot分析。 D总、核和细胞质组分中FOXO1、p-FOXO1/FOXO1和SP1表达的定量分析。 E不同组中p-FOXO1、FOXO1、 SP1和SGLT-2的代表性免疫荧光染色图像。 F相对mRNA表达水平 FOXO1、SP1和 SLC5A2（通过qPCR测定）。Western blot和密度分析采用n = 4个独立生物学重复；2-NBDG摄取、免疫荧光和qPCR实验采用n = 3个独立生物学重复。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs model; <0.05, #<0.01, ##<0.001 vs 对照组。

图6：FOXO1和SP1通过BBR介导调控SGLT-2表达

A在FOXO1过表达和BBR处理的高糖（HG）条件下，HK-2细胞中Flag、SP1和SGLT-2表达的Western blot分析。B通过qPCR测定所示组中FOXO1、SP1和SLC5A2的相对mRNA表达水平。C 代表性互作内源性共免疫沉淀实验支持FOXO1与SP1在HK-2细胞中的结合。正常IgG作为阴性对照。 D 双荧光素酶报告基因实验显示，FOXO1过表达降低了 SP1 启动子-报告基因活性，而SP1过表达降低了野生型（WT） SLC5A2 启动子-报告基因活性；这种效应在突变（MUT）报告基因中不再观察到。 E 西方印迹分析了HK-2细胞中经高糖、BBR和SP1依赖性转录抑制剂米特拉霉素A（MMA）处理后的SP1和SGLT-2表达。 F 代表免疫荧光染色图像，显示在所示处理条件下HK-2细胞中FOXO1/SP1和SGLT-2/SP1的表达。细胞核用DAPI进行反染。qPCR、双荧光素酶报告基因和免疫荧光实验均进行了n = 3个独立生物学重复。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001。

PART 06

结论

BBR改善了糖尿病模型中的代谢异常、肾功能和肾结构损伤。这些效果伴随着肾SGLT-2表达的降低、尿糖排泄的增加以及FOXO1和SP1表达的变化。总体而言，这些发现支持FOXO1/SP1/SGLT-2调控轴可能参与了BBR介导的肾小管葡萄糖处理调节以及糖尿病肾损伤的改善。

机制解析

BBR降低了db/db小鼠的血糖水平并增加了尿糖排泄，同时伴随着肾脏SGLT-2表达的降低和糖尿病肾损伤的减轻。在暴露于高糖环境的HK-2细胞中，BBR增加了FOXO1的Ser256磷酸化，减少了核内FOXO1的积累，恢复了SP1蛋白的表达，降低了SGLT-2的表达，并减少了细胞葡萄糖摄取。

一图概括

科研启示｜这篇文章值得我们借鉴的思路

1.中药单体机制文章套路参考：网络药理生信做假设，不能完全依赖生信筛通路；部分关键分子（本研究中的SP1）可以从文献引入假说，再靠细胞分子实验验证，不强行等待生信输出全部靶点。

2.机制研究务必做反向验证闭环：只做药物处理看蛋白变化是相关性；必须增加：过表达/敲降靶基因、通路特异性抑制剂，看药物效应是否被逆转，证明因果关系，实现完美闭环。

3.中药多靶点客观看待结果：小檗碱降糖并非剂量依赖性，提示它不是选择性SGLT-2抑制剂，降糖来自肝脏、肠道、肾脏多重靶标共同作用，不能把全部药效归因单一条通路。

4.临床转化安全性评价：小檗碱与SGLT-2抑制剂联合使用，虽代谢肾指标改善，但需要警惕肝酶潜在风险，给后续动物、临床前研究提示安全性评估必要性。

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