PNAS | 类受体激酶PERK15整合胞外ATP与水杨酸信号激活植物免疫的分子机制

植物固着生长，无法通过移动规避病原菌 侵染等环境胁迫，因此演化出了多层精密的免疫调控系统。胞外三磷酸腺苷（extracellular ATP, eATP）作为经典的损伤相关分子模式（DAMP），是植物感知细胞损伤与胁迫的核心 “危险信号”，能够快速触发下游免疫反应。水杨酸（salicylic acid, SA）则是植物防御体系中的核心激素，介导系统获得性抗性的建立。已有研究表明 eATP 与 SA 信号通路存在协同调控效应，但二者如何在分子层面整合、共同激活植物免疫应答的机制尚不清楚。

近日，美国密苏里大学Gary Stacey团队在PNAS在线发表了题为“A receptor-like kinase pair integrates extracellular ATP and salicylic acid signaling to activate plant immunity”的研究论文。研究鉴定到一个功能尚未被解析的脯氨酸富集伸展蛋白样类受体激酶 ——PERK15，它作为关键分子枢纽，一方面在蛋白层面被 eATP 受体 P2K1 直接磷酸化激活，另一方面在转录层面受 SA 诱导上调表达，并通过促进 SA 受体 NPR1 的蛋白积累放大防御信号，最终实现 eATP 与水杨酸两条通路的协同免疫激活。

PERK15 与 eATP 受体 P2K1 直接互作，正向调控 eATP 免疫信号

研究团队基于前期 P2K1 互作组的筛选结果，锁定了候选蛋白 PERK15—— 这是 PERK 类受体激酶家族中功能未知的成员。亚细胞定位实验证实，PERK15 定位于细胞质膜，与 eATP 受体 P2K1 的定位模式一致，为二者的功能互作提供了空间基础。研究人员通过免疫共沉淀（Co-IP）、荧光素酶互补成像（LCI）、双分子荧光互补（BiFC）及体外 pull-down 等多种实验体系，从体内、体外多个层面验证了 PERK15 与 P2K1 的直接相互作用。关键的是，eATP 处理能够显著增强二者的互作强度，且这种互作不依赖于 PERK15 自身的激酶活性。

在功能层面，perk15 突变体表现出明显的 eATP 响应缺陷：eATP 诱导的胞质钙峰显著降低，WRKY46、TAT3、CML39 等 eATP 响应标记基因的诱导表达大幅减弱。相应地，perk15 突变体对丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性显著下降，eATP 介导的抗病增强效应也几乎丧失。这些结果明确证明，PERK15 是 eATP 信号通路的正调控因子，是 eATP 介导植物免疫所必需的关键组分。

P2K1 磷酸化 PERK15 激酶，是其免疫激活功能的核心开关

类受体激酶之间的信号传递往往依赖磷酸化修饰。研究人员通过体外激酶实验证实，P2K1 可以直接对 PERK15 进行转磷酸化，且该过程依赖 P2K1 自身的激酶活性；反之，PERK15 无法磷酸化 P2K1，说明二者之间是单向的磷酸化调控关系。结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与定点突变分析，研究人员精准鉴定了 PERK15 上 5 个关键的 P2K1 磷酸化位点：其中 4 个位点（T297、S300、T301、T306）成簇分布在激酶结构域的激活环区域，第 5 个位点（S465）位于 C 端区域。将这 5 个位点全部突变为丙氨酸的五突变体（QuinA），完全失去了被 P2K1 磷酸化的能力。

在拟南芥中过表达野生型 PERK15 会导致植株矮化、PR1/PR2 等防御基因组成型高表达，呈现典型的自身免疫表型；而过表达磷酸化位点缺失的 PERK15 突变体（QuadA/QuinA）则无法触发自身免疫，植株生长状态与抗病性均与野生型无显著差异。进一步的遗传实验显示，PERK15 过表达引发的自身免疫表型在 p2k1 突变体背景下明显减弱，在 P2K1 过表达背景下则进一步增强。这些结果共同表明，P2K1 介导的激活环磷酸化是 PERK15 激活并行使免疫功能的核心分子开关。

SA 上调 PERK15，PERK15 通过促进 NPR1 蛋白积累放大防御信号

PERK15 的转录表达受水杨酸显著诱导。通过 PERK15 启动子驱动的 GUS 报告系统与定量 PCR 验证，SA 处理可明显上调 PERK15 的表达水平，提示 PERK15 同时参与 SA 信号通路的调控。为解析 PERK15 与 SA 通路的遗传关系，研究人员分别在 SA 合成缺陷突变体 sid2-2、SA 降解转基因株系 NahG 以及 SA 受体突变体 npr1-0 中过表达 PERK15。结果显示，PERK15 过表达引发的自身免疫表型在 sid2-2 和 NahG 背景下不受影响，但在 npr1-0 突变体中几乎完全消失。这说明 PERK15 介导的免疫激活不依赖于内源 SA 的合成，却严格依赖 SA 受体 NPR1 的存在。

深入的机制探究发现，PERK15 过表达并不改变 NPR1 的转录水平，但能显著提升 NPR1 的蛋白积累量；反之，perk15 突变体中 NPR1 的蛋白水平明显低于野生型。体外激酶实验排除了 PERK15 直接磷酸化 NPR1 的可能，提示 PERK15 可能通过间接调控 NPR1 的泛素化降解过程，维持其蛋白稳定性，从而放大 SA 介导的防御信号。

eATP 与 SA 通过 PERK15 协同调控植物防御反应

PERK15 同时接受 eATP 的翻译后激活与 SA 的转录上调，提示它是两条信号通路的关键交叉调控节点。转录组数据分析显示，eATP 与 SA 分别诱导的基因存在大量重叠，重叠基因高度富集于生物胁迫响应、防御反应等生物学过程。二者共同处理时，WRKY40、WRKY51、PAD4 等关键防御基因的表达呈现显著的协同诱导效应。而在 perk15 突变体中，不仅 eATP 和 SA 单独处理诱导的防御基因表达大幅减弱，二者的协同诱导效应也显著下降。对 eATP 与 SA 共同处理的转录组进一步分析证实，大量防御相关基因 —— 包括 WRKY 转录因子、类受体激酶、NLR 抗病蛋白、钙信号及 MAPK 通路组分等 —— 的诱导均依赖于 PERK15。这些结果充分证明，eATP 与 SA 通过 PERK15 实现信号整合，协同激活植物的免疫应答。

综上所述，该研究鉴定到 PERK15 作为 eATP 与 SA 信号通路的关键整合节点，清晰勾勒出 “胞外危险信号感知 — 受体激酶互作磷酸化 — 内源激素信号放大” 的调控通路，加深了对植物 eATP 信号与防御激素信号交叉对话的机制的理解。同时，该研究也为 PERK 类受体激酶家族在植物免疫中的功能提供了明确的分子机制，拓展了植物类受体激酶信号网络的调控图景，为作物抗病遗传改良提供了新的理论靶点与基因资源。

论文链接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2616716123