Phytomedicine｜山东中医药大学揭示芪蛭益肾胶囊抗早期糖尿病肾病AMPK/SIRT1/PGC-1α的新机制

【写在前面】：本期推荐的是由山东中医药大学药学院合作近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，揭示芪蛭益肾胶囊治疗早期糖尿病肾病的化学表征及药理机制。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

糖尿病肾病（DKD）常见于糖尿病患者，被认为是终末期肾病（ESRD）的主要原因。近几十年来全球糖尿病的增长直接推动了DKD病例和诊断率的上升，对公共卫生构成严重威胁。多种疾病机制参与DKD的复杂发病机制，包括高血糖诱导的氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍和凋亡。尽管目前DKD的临床管理主要侧重于控制血糖和血压，并使用肾素-血管紧张素系统抑制剂来减缓疾病进展，但这些策略存在局限性，无法完全阻止疾病发展。因此，寻找新的治疗方法和有效药物仍是一个关键目标。

今天分享的这篇文章采用了“化学表征 → 网络药理学/分子对接预测 → 体内药效验证 → 代谢组学机制探索 → 体外细胞验证 → 关键通路验证 → 机制总结”的逻辑主线首次揭示芪蛭益肾胶囊治疗早期糖尿病肾病的化学表征及药理机制。

【化学表征】

芪蛭益肾胶囊（QZC）是2021年中国获批临床应用的12种中药新药之一。它由山东凤凰制药有限公司和重庆市中药研究院基于中医理论系统收集和评价DKD的经典方剂、名方、经验方和单方联合开发。最终处方源自全国名中医邹燕勤教授的临床经验方，她在治疗DKD方面拥有多年经验。该方由十味配伍精当的药材组成，包括黄芪（AR）、地黄（RG）、女贞子（LLF）、水蛭（H）、土鳖虫（ES）、僵蚕（BB）、熟大黄（RRRP）、匙羹藤叶（GF）、青风藤（SC）和车前子（PS）。其中，AR为君药，具有补气固表之功；RG和LLF滋阴补肾；H和ES促进血液循环、消除血瘀；BB和RRRP清热通便；GF和SC祛风除湿；PS利水渗湿。诸药合用，产生益气养阴、活血通络的传统功效。临床研究证实，QZC对气阴两虚证早期DKD患者具有显著的肾脏保护作用，可显著改善症状并延缓疾病进展。

QZC是一种复杂的多草药制剂，其化学成分应充分表征，以确保药理学研究的可重复性和一致性，符合草药物质和草药制剂表征原则。最近报道了研究人员使用UPLC-Q-TOF-MS/MS和HPLC指纹图谱对QZC进行综合化学表征的策略，通过该策略表征了103种化学成分，并建立了用于制剂质量评价的互补色谱方法。该研究进一步证明了多组分指纹图谱和定量分析在QZC质量评估中的实用性。在此已建立的分析框架基础上，本研究在药理学研究之前，通过HPLC指纹图谱分析、代表性化学标志物的鉴定和黄芪甲苷IV的定量测定进一步表征了QZC制剂。

作者先对 QZC 进行 HPLC 指纹图谱和化学表征，明确其化学一致性，为后续药理实验提供质量基础。

• A：QZC 的 HPLC 指纹色谱图，显示多个特征峰，反映复方复杂化学组成。

• B：通过与对照品比较保留时间，鉴定特征峰，包括腺苷、儿茶素、木犀草素、大黄素、大黄酚等。

结果表明证明 QZC 批次间化学一致性较好，为后续药效和机制研究提供质量可控的样品基础。

【 网络药理学/分子对接预测】

用网络药理学预测 QZC 抗 DKD 的活性成分、核心靶点和信号通路，重点关注 PI3K-Akt、AMPK、MAPK 等。

• A：QZC 相关靶点与 DKD 相关靶点的 Venn 图，得到 1,436 个共同靶点。

• B：PPI 网络，展示核心靶点如 TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1、EP300 等。

• C：GO 富集条形图，涉及线粒体电子传递、蛋白质磷酸化、有氧呼吸等生物过程。

• D：KEGG 通路气泡图，富集到 PI3K-Akt、AMPK、MAPK 等通路。

• E：DKD 干预关键信号通路示意图，突出 PI3K-Akt、MAPK、AMPK。

作者预测 QZC 通过多成分、多靶点、多通路发挥作用，并锁定 AMPK 相关通路 。

作者用分子对接验证 QZC 关键成分 GLA、MC 与 AMPK、SIRT1、PGC-1α 的结合能力，为机制研究提供结构依据。

• A-F：GLA、MC 分别与 AMPK、SIRT1、PGC-1α 的分子对接结果。

结果表明显示 GLA、MC 与 AMPK/SIRT1/PGC-1α 具有较强结合亲和力，为后续机制验证提供结构基础 。

【体内药效验证】

作者进一步在 DKD 大鼠模型中验证 QZC 联合 MET 的肾脏保护作用，包括血糖、肾脏指数、血脂、肾功能、组织病理和足细胞超微结构。

• A：治疗 4 周后空腹血糖（FBG）。

• B：肾脏指数。

• C-H：血清 TG、TC、HDL、LDL、Scr、BUN 水平。

• I：肾脏和肝脏组织病理染色及 TEM。HE、PAS、Masson 观察肾组织病理和纤维化。Oil Red O 观察肝脏脂质沉积。TEM 观察肾小球足细胞足突超微结构。

结果表明 QZC 联合 MET 可改善 DKD 大鼠糖脂代谢、肾功能、组织病理和足细胞损伤 。

【代谢组学机制探索】

作者通过非靶向代谢组学寻找 QZC 治疗 DKD 的差异代谢物和代谢通路，聚焦酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸代谢。

• A-B：正、负离子模式下 PCA 得分图，NC 与 M 组明显分离，QZC/MET 组位于两者之间。

• C：OPLS-DA 得分图，进一步确认组间差异。

• D-E：火山图，展示 M vs NC、QZC vs M 的差异代谢物。

• F：代谢通路富集分析，主要涉及酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢等。

结果 提示 QZC 可能通过调节氨基酸代谢和能量代谢相关通路，减轻氧化应激和代谢紊乱 。

【体外细胞验证】

本研究基于网络药理学分析选择γ-亚麻酸（GLA）和咖啡酸甲酯（MC）作为单体化合物进行研究。GLA和MC在QZC活性化合物中的度值分别排名第5和第22位，表明其在药物-靶点相互作用网络中具有高潜在活性。因此，作者在 HK-2 细胞高糖损伤模型中验证 QZC 及单体 GLA、MC 对凋亡、细胞周期和 ROS 的影响。

• A：Annexin V/PI 流式细胞术检测凋亡。

• B：流式细胞术分析细胞周期。

• C：ROS 荧光检测。

• D：CCK-8 检测不同浓度 QZC、GLA、MC 对 HK-2 细胞活力的影响。

• E：凋亡定量。

• F：细胞周期分布定量。

• G：细胞内 ROS 水平定量。

结果表明QZC、GLA、MC 均可抑制高糖诱导的 HK-2 细胞凋亡、调节细胞周期并降低 ROS，提示其通过减轻氧化应激发挥保护作用 。

【关键通路验证】

随后作者用 WB 和 qRT-PCR 验证 QZC、GLA、MC 对 AMPK/SIRT1/PGC-1α 通路的调控。

• A：大鼠肾组织中 AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 的 WB 条带。

• B：大鼠肾组织蛋白定量。

• C：HK-2 细胞中相关蛋白 WB 条带。

• D：QZC 处理组 HK-2 细胞蛋白定量。

• E：GLA、MC 处理组 HK-2 细胞蛋白定量。

• A：大鼠肾组织中 AMPK、SIRT1、PGC-1α mRNA 表达

• B：QZC 处理的 HK-2 细胞中相关基因表达。

• C：GLA 处理的 HK-2 细胞中相关基因表达。

• D：MC 处理的 HK-2 细胞中相关基因表达。

结果表明QZC、GLA、MC 可恢复高糖或 DKD 状态下 AMPK/SIRT1/PGC-1α 通路相关蛋白表达，且从转录水平验证 QZC、GLA、MC 可上调 AMPK/SIRT1/PGC-1α 轴 。

【结论与讨论】

综上，本研究表明QZC在DKD中发挥多靶点肾脏保护作用，在体内改善肾小球和足细胞损伤，同时在体外保护HK-2细胞免受高糖诱导的损伤。这些保护作用与调节AMPK/SIRT1/PGC-1α通路、减少氧化应激和抑制凋亡有关。这些结果为QZC的临床应用奠定了理论基础，并为推进中药复方现代化提供了新策略。

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