食品中二氧化硫的测定——第二法 分光光度法操作步骤

方法原理

样品直接用甲醛缓冲吸收液浸泡，或加酸充氮蒸馏，使二氧化硫释放并被甲醛溶液吸收，生成稳定的羟甲基磺酸加成化合物。在酸性条件下，该化合物与盐酸副玫瑰苯胺反应，生成蓝紫色络合物，在特定波长下测定吸光度，二氧化硫浓度与吸光度成正比。本方法包含直接提取法和充氮蒸馏提取法两种前处理方式：直接提取法适用于白糖及白糖制品、淀粉及淀粉制品和生湿面制品；充氮蒸馏提取法适用于葡萄酒及赤砂糖。

试剂与材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为三级水。

• 氨基磺酸铵
• 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）
• 甲醛：36%～38%，应不含聚合物（无沉淀且溶液不分层）
• 邻苯二甲酸氢钾
• 2%盐酸副玫瑰苯胺溶液
• 冰乙酸
• 磷酸
• 氢氧化钠
• 盐酸：ρ₂₀ = 1.19 g/mL
• 氮气：纯度＞99.9%
• 二氧化硫标准溶液：100 μg/mL，具有国家认证并授予标准物质证书

试剂配制：

• 氢氧化钠溶液（1.5 mol/L）：称取6.0 g氢氧化钠，溶于水并稀释至100 mL。
• EDTA-2Na溶液（0.05 mol/L）：称取1.86 g EDTA-2Na，溶于水并稀释至100 mL。
• 甲醛缓冲吸收储备液：称取2.04 g邻苯二甲酸氢钾，溶于少量水中，加入36%～38%甲醛溶液5.5 mL、0.05 mol/L EDTA-2Na溶液20.0 mL，混匀，加水稀释并定容至100 mL，贮于冰箱中冷藏保存。
• 甲醛缓冲吸收液：量取甲醛缓冲吸收储备液适量，用水稀释100倍，临用时现配。
• 盐酸副玫瑰苯胺溶液（0.5 g/L）：量取2%盐酸副玫瑰苯胺溶液25.0 mL，分别加入磷酸30 mL和盐酸12 mL，用水稀释至100 mL，摇匀，放置24 h后备用，避光密封保存。
• 氨基磺酸铵溶液（3 g/L）：称取0.30 g氨基磺酸铵，溶于水并稀释至100 mL。
• 盐酸溶液（6 mol/L）：量取盐酸50 mL，缓缓倒入50 mL水中，边加边搅拌。
• 二氧化硫标准使用液（10 μg/mL）：准确吸取二氧化硫标准溶液（100 μg/mL）5.0 mL，用甲醛缓冲吸收液定容至50 mL，临用时现配。

玻璃充氮蒸馏器

仪器与设备

• 玻璃充氮蒸馏器：500 mL或1000 mL，或等效蒸馏设备
• 紫外可见分光光度计
• 恒温水浴：控温精度±1℃
• 比色管：25 mL，具塞
• 比色皿：1 cm
• 分析天平：感量0.01 g
• 粉碎机、组织捣碎机等辅助设备

分析步骤

试样制备

同酸碱滴定法。液体试样混合均匀后取样；固体试样粉碎后充分混匀；半流体试样用组织捣碎机捣碎混匀。

试样处理

直接提取法（适用于白糖及白糖制品、淀粉及淀粉制品、生湿面制品）：

称取固体试样约10 g（精确至0.01 g），加甲醛缓冲吸收液100 mL，振荡浸泡2 h，过滤，取滤液待测。同时做空白试验。

充氮蒸馏提取法（适用于葡萄酒及赤砂糖）：

将处理好的试样放入蒸馏瓶中，在接收瓶中加入甲醛缓冲吸收液作为吸收液。开通氮气，调节流量至1.0～2.0 L/min。从分液漏斗向蒸馏瓶中加入6 mol/L盐酸溶液，立即加热蒸馏，使二氧化硫随氮气带出并被甲醛吸收液吸收。冷凝水温度控制在15℃以下。蒸馏结束后收集吸收液，定容待测。同时做空白试验。

标准曲线绘制

取7支25 mL具塞比色管，分别加入二氧化硫标准使用液（10 μg/mL）0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL，用甲醛缓冲吸收液补足至总体积5.0 mL。

向各管中加入0.5 mL氨基磺酸铵溶液（3 g/L），混匀，放置10 min以消除氮氧化物的干扰。

加入1.0 mL氢氧化钠溶液（1.5 mol/L），摇匀。

加入1.0 mL盐酸副玫瑰苯胺溶液（0.5 g/L），立即混匀，用甲醛缓冲吸收液定容至刻度。

将比色管置于恒温水浴中显色。显色温度与显色时间需对应控制：10℃显色40 min，15℃显色25 min，20℃显色20 min，25℃显色15 min，30℃显色5 min。显色温度与室温之差不宜超过3℃。

以零浓度管调节零点，在波长577 nm处用1 cm比色皿测定各管吸光度。以二氧化硫质量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定

吸取适量试样处理液（直接提取法取滤液，充氮蒸馏法取吸收液）于25 mL比色管中，用甲醛缓冲吸收液补足至5.0 mL。按标准曲线相同的步骤，依次加入氨基磺酸铵溶液、氢氧化钠溶液、盐酸副玫瑰苯胺溶液，定容，在相同温度和时间条件下显色，于577 nm处测定吸光度。从标准曲线上查得试样管中二氧化硫的质量。

结果计算

试样中二氧化硫的含量按下式计算：

X = (m₁ - m₀) × V / (V₁ × m)

式中：

• X —— 试样中二氧化硫的含量，mg/kg 或 mg/L；
• m₁ —— 测定用试样液中二氧化硫的质量，μg；
• m₀ —— 空白试验中二氧化硫的质量，μg；
• V —— 试样处理液的总体积，mL；
• V₁ —— 测定时吸取试样处理液的体积，mL；
• m —— 试样的质量或体积，g 或 mL。

结果以重复性条件下两次独立测定结果的算术平均值表示。

关键注意事项

• 显色温度与时间须严格对应：显色反应对温度极为敏感，温度越高显色越快但稳定性越差。必须按照10℃/40 min、15℃/25 min、20℃/20 min、25℃/15 min、30℃/5 min的对应关系控制，显色温度与室温之差不宜超过3℃。建议使用恒温水浴保证温度稳定。
• 加入顺序不可颠倒：氨基磺酸铵溶液须在氢氧化钠溶液之前加入，以消除氮氧化物的干扰。氮氧化物会产生负干扰，使测定结果偏低。样品中若存在臭氧，放置20 min后可自行分解。
• 盐酸副玫瑰苯胺溶液需放置24 h后使用：新配制的溶液需避光放置24 h，使试剂充分稳定后方可使用，否则显色灵敏度不稳定。
• 甲醛缓冲吸收液须临用现配：稀释后的吸收液稳定性差，不可放置过久，否则吸收效率下降。
• 比色管须具塞并立即混匀：加入盐酸副玫瑰苯胺溶液后应立即盖塞混匀，避免二氧化硫在显色前逸出损失。
• 测定波长：食品中二氧化硫的分光光度法采用577 nm波长，与部分环境监测标准中使用的波长存在差异，须按食品标准规定执行。
• 标准曲线线性要求：标准曲线相关系数应达到0.999以上，否则应重新绘制。配制标准系列时应使用较高等级的玻璃量器，减少配制步骤带来的误差。