Nature | AlphaFold结构挖掘发现GPCR样蛋白TM184C调控胞间囊泡运输与自噬

撰文 | 阿童木

尽管蛋白质是生命活动最重要的执行分子之一，人类对“蛋白质世界”的认识仍十分有限。现有数据库中收录了海量蛋白质序列，但真正经过实验验证和人工审阅的只占极小比例。例如，UniProtKB/Swiss-Prot中仅约57万个蛋白质序列经过人工整理，仅占已收录序列的约0.2%；相比之下，超过2.45亿条序列主要依赖计算方法，根据与已知蛋白质的序列相似性推测其功能和家族归属【1】。这意味着，大量蛋白质的真实功能仍停留在预测层面；对于一些高度序列分化的蛋白，传统序列比对甚至难以识别其与已知蛋白之间潜在的进化和功能联系。

这一认知局限 在人类蛋白质组中同样突出。按照靶点开发水平（TDL），人类蛋白质可分为Tclin、Tchem、Tbio和Tdark四类，分别代表已被临床药物靶向、具有高效小分子配体、已有较充分生物学研究以及功能研究极为有限的蛋白质【2】。其中，Tdark代表这一分类中研究程度最低的一类蛋白。在20,412个人类蛋白质中，仍有约27%被归为Tdark。这些研究不足的蛋白构成人类“暗蛋白组”中最为未知的一部分，也可能蕴藏尚未发现的生物学机制和潜在治疗靶点。

近 日，University of Miami的 Daniel G. Isom 团队在 Nature 发表 了 题为 TM184C is a GPCR-like regulator of intercellular exchange and autophagy 的研究 论文 。 通过大规模挖掘AlphaFold预测结构，作者发现TM184和PRRT两个此前未被识别的superdark GPCR样七 重 跨膜蛋白家族。TM184C可接受GRK磷酸化并招募β-arrestin，调控胞内囊泡运输、胞间连接及物质交换， 并 限制自噬体积累，其自噬调控功能在 进化 中高度保守 。

作者提出 “superdark protein” 这一 概念，用以描述那些 与已知功能蛋白缺乏明确序列同源关系、但可能仍具有结构同源性的 缺乏研究的 蛋白 。为寻找这类蛋白，研究人员以经典GPCR视紫红质的七跨膜结构作为 检索 模板，对AlphaFold数据库中超过2.14亿个预测蛋白结构进行了系统比对。经过结构覆盖、拓扑完整性以及UniProt和InterPro注释等多层筛选后， 共获 得了 超过140万个七跨膜结构匹配 。其中约35%已经被归类为GPCR，其余则属于不同类型的非GPCR七跨膜蛋白。

在人类蛋白中，研究人员进一步找到6个此前没有被明确归入GPCR家族的候选蛋白， 主要属于OSTα/TM184和PRRT两个家族 。由于TM184C表达最广泛，同时具有较高的进化保守性，作者将其作为后续研究的重点。

经典GPCR最重要的特征之一是激活异源三聚体G蛋白。研究人员因此首先利用4A、mini-G和TRUPATH等体系检测TM184C的G蛋白偶联能力，但均 没有获得稳定而明确的组成性G蛋白偶联证据 。这意味着TM184C并不能简单归入传统GPCR。

然而，对TM184C序列进一步分析后，作者发现其C端存在多个类似经典GPCR的arrestin code ，该 序列通常能够接受GPCR kinase磷酸化，并进一步促进β-arrestin结合。实验结果显示，TM184C能够招募β-arrestin，而删除TM184C C端82个氨基酸后，ARRB2招募降低，Co-IP也显示TM184C与ARRB1和ARRB2的结合减少。GRK2、GRK3、GRK5和GRK6均可增强TM184C与β-arrestin的相互作用，其中GRK2作用最为明显。质谱进一步鉴定出S422、S432和S435 三个 C端磷酸化位点。将arrestin code中的多个潜在磷酸化残基突变后，TM184C对β-arrestin的结合也随之下降。因此， TM184C虽然缺乏明确的G蛋白偶联，却保留了GRK磷酸化—β-arrestin招募这一经典GPCR调控模块 。作者据此认为， TM184C可能代表一类此前没有被认识的arrestin-coupled GPCR-like蛋白 。

与典型质膜GPCR不同，TM184C主要并不定位于细胞表面。免疫荧光显示， 内源TM184C主要呈胞内囊泡样分布；外源表达的TM184C–eGFP进一步与晚期内体、溶酶体和LC3B阳性自噬体标记物共定位 。活细胞成像进一步发现，TM184C阳性囊泡可以沿微管快速双向移动，并不断发生裂变和融合。大量TM184C囊泡还会进入细长的细胞突起，并在突起远端积累。相邻细胞的这些突起有时能够进一步接触并形成长距离细胞间连接，其形态类似于此前报道的隧道纳米管和肿瘤微管。

为了判断TM184C是否直接参与这些结构的形成， 作者 利用CRISPR 敲低T M184C水平。TM184C 受抑制 后，细胞明显趋于圆形，细胞突起和细胞间连接大量减少，同时出现酸性囊泡增大和定位异常。相反，稳定过表达TM184C能够产生大量细长突起和细胞间桥。进一步的 拯救 实验显示，完整TM184C能够维持这一高度连接的细胞形态，而破坏C端arrestin code或直接删除C端后，TM184C促进细胞间连接的能力明显下降。这表明， TM184C依赖其GRK和β- arrestin 相关C端调控区域促进细胞突起和细胞间网络形成 。

此外，作者发现 TM184C能介导双向囊泡交换 。相比之下，TM184A和TM184B主要定位于质膜，与TM184C细胞共培养后，囊泡转移主要从TM184C细胞流向TM184A或TM184B细胞。破坏TM184C C端arrestin code同样改变了这种转移模式。作者进一步将这一现象扩展至HFF-1成纤维细胞、星形胶质细胞、患者来源胶质母细胞瘤细胞和SK-MEL-28黑色素瘤细胞，均观察到TM184C阳性的细胞间连接和囊泡交换。此外，TM184C阳性囊泡还与线粒体保持紧密动态关联，并频繁出现“kiss-and-go”式接触，作者据此提出， TM184C阳性囊泡可能 支持 或辅助跨细胞代谢 。总体而言， β-arrestin和GRK依赖的GPCR样调控机制参与TM184C的囊泡运输、细胞间连接和物质交换 。

由于TM184C还定位于LC3B阳性的自噬结构， 作者 进一步分析 了 其是否参与自噬调节。降低TM184C表达后，脂化形式LC3B-II明显积累。进一步使用抑制溶酶体酸化的concanamycin A后，LC3B-II仍能够继续升高，说明TM184C缺失并非主要造成自噬体降解阻断，而更可能增强了自噬体生成。因此， TM184C主要通过限制LC3B脂化和自噬体生成/积累，对自噬过程发挥负向调控作用 。

此外， 进化分析将TM184家族追溯至古菌起源，提示其功能早于多细胞生命。在酵母中， 敲除 同源基因HFL1会产生多囊泡液泡表型，而敲入人类TM184C可完全挽救该表型 。 此前研究还发现，Hfl1能够与哺乳动物LC3B的酵母同源蛋白Atg8发生相互作用。这些结果表明， TM184C参与的囊泡和自噬调控具有非常古老的进化基础，并提示在多细胞生物中，这一古老的膜运输调控机制可能进一步参与细胞突起形成和细胞间物质交换 。

总体而言，该研究 一方面提供了一种基于蛋白质结构而非序列同源性的“暗蛋白”发现策略，另一方面揭示了一个此前了解有限的七 重 跨膜蛋白TM184C。TM184C并非典型的G蛋白偶联受体，而是保留GRK–β-arrestin调控特征的GPCR样蛋白，并将这一调控模块连接到胞内囊泡运输、自噬以及细胞间物质交换 。随着AlphaFold等工具不断扩展已知蛋白结构空间，类似的 结构优先策略 可能帮助研究人员从大量缺乏功能注释的蛋白中，进一步 发现隐藏在序列差异背后的保守细胞生物学机制 。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10993-8

制版人： 十一

参考文献

1. UniProt Consortium UniProt: the universal protein knowledgebase in 2023.Nucleic AcidsRes.51, D523–D531 (2023).

2. Nguyen, D. T. et al. Pharos: Collating protein information to shed light on the druggable genome.Nucleic Acids Res.45, D995–D1002 (2017).

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