NAR | 新型V型CRISPR效应核酸酶，Cas12家族专切tRNA的“异类”

提到CRISPR，大多数人的第一反应是"基因剪刀"——Cas9、Cas12a像一把精确的手术刀，在DNA上找到指定位置然后切断。

最近，山东大学佘群新/冀世奇课题组在Nucleic Acids Research上发表的一项题为BaCas12a3 represents a new subtype of type V CRISPR effector with collateral activity toward tRNA新研究，又给Cas12家族添了一个新成员——BaCas12a3。它的特别之处在于：识别噬菌体RNA之后，它不去切DNA，而是直接剪断细胞里tRNA的3'端CCA尾巴。

CRISPR-Cas12家族包含多种RNA引导的核酸酶效应蛋白，兼具DNA靶向和RNA靶向亚型，可通过直接清除入侵核酸或激活广泛的旁切活性诱导流产感染，从而发挥抗病毒免疫功能。其中，经典Cas12a被激活后可特异性切割双链DNA，Cas12a2可通过非特异性降解双链DNA实现流产感染。但CRISPR系统是否还存在其他类型的免疫机制，还有待进一步探索。

本研究报道了一种新型V型CRISPR效应蛋白 BaCas12a3，其通过独特的tRNA切割机制导致宿主生长停滞。质粒干涉实验和Western blot检测表明，BaCas12a3可诱导细菌生长抑制，但不引发DNA损伤反应，提示其不存在双链DNA切割活性。生化表征结果显示，BaCas12a3-crRNA核糖核蛋白复合物是一种RNA激活的核酸酶，可特异性切割tRNA 3'端的CCA保守序列。冷冻电镜结构解析揭示了BaCas12a3具有保守的双叶架构，并在RuvC催化中心附近存在一个独特的tRNA加载结构域（tRLD）（图1）。结构分析与突变验证表明，tRLD结构域与锌指结构域共同形成门控式底物凹槽；靶标RNA结合后诱发构象变化，打开凹槽并暴露RuvC活性位点，实现对tRNA 3'端的特异性切割，同时避免其他非 特异性降解（图1）。

图1. BaCas12a3的冷冻电镜结构研究。(A) BaCas12a3、SuCas12a2和FnCas12a的结构比较；(B) RuvC结构域催化中心分析；(C)靶RNA结合诱导结构重排以实现激活，运动矢量图和圆柱/短线段形式展示的BaCas12a3结构域重组；(D) 通过三元复合物结构的3D分类解析的tRLD结构域构象变化。

含有该系统的菌株，在发生噬菌体入侵时，其免疫过程可推断如下：表达后， BaCas12a3与成熟crRNA组装成一种监视状态，该状态对RNA切割处于自抑制；噬菌体感染后，crRNA与来源于入侵者的互补靶RNA转录本碱基配对，以扫描兼容的PFS基序，靶RNA引导的RNA相互作用诱导Cas12a3效应蛋白发生大规模构象变化，从而打开底物沟槽并暴露RuvC活性位点；最终，被激活的BaCas12a3切割细胞tRNA的3′ CCA末端，不可逆地使tRNA失活而无法进行氨酰化，从而阻断全局细胞翻译（图2）。因此，Cas12a3免疫不仅阻止宿主和噬菌体基因组的复制，还诱导生长停滞，以防止噬菌体在细菌群体中传播。本研究对BaCas12a3系统性的研究，拓展了CRISPR免疫功能多样性的认知，也为开发新型RNA靶向工具提供了分子基础。

图2. BaCas12a3识别靶RNA后切割tRNA CCA尾实现免疫防御的机制示意图。

对做CRISPR基础研究的人来说，这个发现至少说明了三点。

第一，CRISPR免疫的多样性比我们想象的还要大。过去大家提到CRISPR的侧链切割活性，想到的都是切DNA。Cas12a2的发现已经让人意外了——原来还能通过破坏DNA来实现流产感染。现在BaCas12a3又打开了一个新方向：原来还能通过切断tRNA来停止蛋白质合成。细菌对抗病毒的手段，远比我们之前知道的要丰富。

第二，tRLD结构域的发现，拓展了我们对CRISPR蛋白底物识别机制的理解。RuvC催化中心本来是切核酸的，但旁边加一个什么样的"定位器"，就能决定它切什么。这个tRLD就是一个很好的例子——它不参与催化，只负责把tRNA的CCA尾精准送到RuvC的活性位点上。这种"催化核心通用+底物识别模块多样"的结构设计思路，可能在CRISPR家族里比我们以为的更普遍。

第三，它有潜在的技术应用价值。一个能精准识别tRNA并剪掉CCA尾的酶，理论上可以用来调控翻译活性，甚至开发成新的分子工具。

山东大学微生物技术研究院、微生物改造技术全国重点实验室佘群新教授和冀世奇副教授为本文的共同通讯作者，博士研究生李鑫为论文第一作者。山东大学/华中农业大学杜磊教授为文章做出重要贡献。

文章链接：https://academic.oup.com/nar/article-abstract/doi/10.1093/nar/gkag915/8826924

制版人：十一

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