Nature | ABEs：在PCSK9位点实现高效碱基编辑且人类胚胎发育正常

撰文|章台柳

基因编辑系统可诱导产生明确且靶向的基因损伤（DNA双链断裂、单链切口、错配或无碱基位点），是研究DNA修复通路的重要工具。使用CRISPR-Cas9开展的研究发现，人类胚胎存在DNA双链断裂（DSB）修复的缺陷，会频繁引发染色体片段异常及整条染色体畸变。在人类着床前胚胎中，非整倍体往往会造成胚胎发育失败。基因编辑为理解人类发育早期维持基因组完整性的调控机制提供了强有力手段，并有望为疾病预防提供新策略。

在小鼠和人类细胞中，研究显示Cas9诱导的DNA DSB在靶向和非靶向位点产生基因毒性，包括大片段缺失、非整倍体、复杂的染色体重排以及染色体碎裂。在CRISPR-Cas9靶向处理后，小鼠和人类胚胎中不仅检测到染色体丢失，也检测到大片段缺失。DNA DSB的这些有害后果难以准确表征，这使得在人类胚胎中利用CRISPR-Cas9变得极不可能。腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）利用Cas9切口酶（nCas9）在目标DNA位点产生单链断裂（SSB）。尽管没有直接诱导DSB，但当DNA复制叉遇到SSB或无碱基位点时，可能导致复制叉停滞并转化为具有基因毒性潜力的DNA DSB。已知的ABEs和CBEs基因毒性包括插入和缺失（indels）、大片段缺失（> 100 bp），以及在不同染色体的多重CBE编辑后出现的易位。在T细胞和小鼠胚胎中，ABE诱导大片段缺失和非整倍体。矛盾的是，最近一项研究发现，单独的切口或ABE诱导的切口和错配并未对小鼠干细胞的染色体完整性产生影响。

通过研究早期人类胚胎中碱基编辑的后果，对于理解早期发育中自发染色体畸变的起源以及评估预防遗传病的潜力具有重要意义。迄今为止，尚无关于人类胚胎中碱基编辑的发育后果、遗传结果和染色体稳定性的全面研究。

近日，来自哥伦比亚大学的Dieter Egli团队在Nature杂志上发表文章Highly efficient base editing at PCSK9 and normal human embryo development，全面评估了碱基编辑器在人类胚胎PCSK9和HBG位点引入的切口和错配DNA修复结果。在受精时将ABE8e-V106W作为蛋白质递送，实现对所有PCSK9等位基因的编辑。未检测到插入或缺失，尽管发生了罕见的靶向染色体断裂和染色体异常。然而，旁观者和脱靶位点的编辑呈嵌合状态，并且以mRNA形式引入编辑器会导致频繁的胚胎停滞，这是由不依赖指导RNA的脱氨酶活性引起的。因此，与Cas9诱导的DNA断裂不同，碱基编辑器诱导的损伤能被有效修复。然而，可能会对基因组和发育产生不良后果，阻碍了其在生殖领域的临床使用。

为了研究单链断裂的DNA修复，研究人员选择PCSK9和HBG1/2作为靶基因设计sgRNA。在PCSK9基因外显子1和内含子1之间的剪接位点进行ABE介导的A→G编辑，从而导致通读和翻译的提前终止。由于PSCK9是一种参与胆固醇代谢的基因，该突变会导致低密度脂蛋白胆固醇降低，降低冠心病的风险。在HBG1和HBG2基因启动子区的-198位进行A→G编辑，这种自然存在的变异会导致成年期胎儿血红蛋白表达，从而改善β-地中海贫血和镰状细胞病的症状。选择ABE8.8-m作为碱基编辑器，在HEK293或hESCs中进行编辑，结果显示选择的sgRNA具有高编辑效率，平均介于70%（HBG1/2）和超过95%（PCSK9）。随后将组合的PCSK9和HBG1/2 sgRNA与ABE8.8-m mRNA注射到双原核（2PN）人类受精卵中，并对单个卵裂球进行Sanger测序。在来自15个胚胎的25个卵裂球中，HBG1位点纯合预期编辑的细胞占52%（13/25），HBG2位点占68%（17/25）。对于来自37个胚胎的64个细胞中分析的PCSK9的mRNA编辑，66%（42/64）的细胞显示出纯合编辑。随后在受精时的MII卵母细胞注射ABE mRNA或RNP，同样显示出高效的sgRNA依赖性靶基因编辑，且在MII阶段递送的ABE8e-V106W RNP能够实现人类胚胎中100%靶点的修饰。

在2PN阶段注射ABE8.8-m mRNA的胚胎中，在第三天显示出异常少的卵裂球数量。继续发育至受精后第六天，仅2个发育至囊胚阶段，大多数胚胎（38/44，86%）停滞在一到四细胞阶段。这种早期胚胎停滞在PCSK9和HBG1/2 sgRNA中都出现了。这种细胞周期停滞阶段对于体外受精（IVF）胚胎来说是不寻常的，因为IVF胚胎通常在需要胚胎基因组激活以推动发育进展的晚期卵裂阶段发生停滞。这种停滞并非由注射本身引起，因为模拟注射对照组的发育显著更好。这也并非由非整倍体引起，因为在停滞的胚胎中，超过一半的细胞（37/64；58%）是整倍体，这是人类卵裂期胚胎中生理正常的频率。这种毒性也不依赖于sgRNA，因为在2PN阶段注射编码碱基编辑器但不含sgRNA的mRNA，同样会导致胚胎停滞在一细胞或两细胞阶段。因此，早期发育停滞很可能是由以mRNA形式递送的ABE8.8-m的不依赖sgRNA的脱氨酶活性引起的。但使用RNP形式递送纯化的ABEmax或ABE8e-V106W蛋白则不影响发育进程，且靶向编辑效率没有受损，甚至更高。向小鼠胚胎中注射编码eGFP蛋白的mRNA或失活ABE8.8-m的mRNA，则小鼠胚胎发育情况显著优于注射活性ABE8.8-m mRNA的胚胎。这说明非特异性编辑器毒性并非由mRNA递送形式所导致，而是与ABE8.8-m脱氨酶催化活性相关。将两种不同的ABE以RNP形式递送，与胚胎的正常发育相容。

注射ABEmax RNP到人类2PN受精卵或受精后的囊胚中衍生的hESC系，检测出PCSK9蛋白的完全缺失，表明编辑的成功。同时具有正常的核型，未检测到结构异常。为了比较碱基编辑与CRISPR-Cas9的染色体后果，研究人员使用相同的sgRNA，分别向胚胎注射这两种编辑器。全基因组分析显示，碱基编辑器组未出现靶向位点附近的插入缺失（indels），与CRISPR-Cas9组存在显著差异。使用长距离PCR结合Nanopore测序来分析大片段缺失，发现来自CRISPR-Cas9编辑胚胎的所有扩增中，超过三分之一出现大片段缺失，这可能是由于：i) 染色体改变导致靶向位点丢失；ii) 缺失长度超过所分析的约1.8-kb区域，导致引物结合位点被移除；或 iii) 存在未修复的DNA DSB或其他无法通过PCR检测到的重排。相比之下碱基编辑器未出现大片段缺失，具有更高的特异性和更低的遗传结果复杂性。分析非整倍体发生情况，碱基编辑胚胎中染色体非整倍体的总体频率（12个由5-12个细胞组成的胚胎的74个细胞中有24个片段性改变）相对于IVF对照组（26个胚胎的145个细胞中有97个片段性改变）并未增加，但确实会发生特定的ABE诱导断裂，不过其发生率远低于Cas9编辑的胚胎。总之，ABE相关染色体改变具有罕见性。

研究人员进一步在hESC中评估了脱靶碱基编辑的情况，发现ABE8e-V106W RNP会在hESCs的转录组中引起编辑，不仅表现在脱靶位点的发现，而且会在RNA中引入不希望的、不依赖sgRNA的修饰。但胚胎中是否存在类似的脱靶活性及其功能后果，需要进一步评估。此外，尽管使用ABE8e-V106W有可能在所有靶等位基因上实现预期修饰，但旁观者和脱靶位点仍存在高度嵌合现象。

总的来说，研究发现ABEs在单细胞阶段的靶向碱基编辑是高效且精确的。碱基编辑后未观察到插入或小/大片段缺失，但检测到罕见的ABE诱导的靶向片段性非整倍体。提示ABEs技术如果要应用于生殖领域的临床，还需要更多的优化。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-11118-x

制版人：十一

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