【JACS】西湖大学叶宇轩：基于生物催化氧化还原级联反应的环戊酮位点选择性直接β-烷基化

导语

羰基化合物是有机合成中最重要的合成砌块之一，其不同位置的选择性官能团化为构建复杂分子提供了丰富的化学空间。围绕羰基碳以及邻近的α位，目前已经发展出大量成熟的成键策略：前者可发生亲核加成，后者可通过烯醇或烯醇盐参与成键。相比之下，更远端且酸性低的β-C(sp³)–H 的直接修饰仍然具有较大挑战，常见做法是先把饱和酮转化为烯酮，再通过共轭加成安装取代基，但这些路线仍需化学计量氧化剂来生成烯酮中间体，因此开发"氧化还原中性"的直接β-官能团化方法极具吸引力。近年来，针对羰基化合物的直接β-烷基化已经出现了多种策略（图1A），包括导向基辅助C−H键活化、迁移偶联、金属催化氧化还原级联、氢原子转移以及烯胺或路易斯酸参与的光氧化还原策略。然而，它们对α-芳基或α-烷基取代的环戊酮基本无效——而这类骨架在药物与生物活性分子中广泛存在。失效原因主要有以下几点：环状结构阻碍了导向基团介导的β-C–H 活化；α-非酰基取代基带来的位阻使催化剂难以在羰基处有效结合（如胺催化）；更关键的是，这类底物存在两个不等价的β-位点。因此，要实现其直接β-烷基化，既需要解决反应活性问题，还必须控制反应究竟发生在哪一个β位点（图1B、C）。

前沿科研成果

研究思路：近年来，西湖大学叶宇轩团队将黄素依赖的"烯"还原酶（ERED）改造为脱氢酶，开发了基于ERED的去饱和化体系在不对称合成中的应用，实现了环己酮化合物的去对称化脱氢，建立了一个通用的酶催化脱氢反应平台（Nat. Chem .2025, 17 , 74-82），其机制为保守酪氨酸残基（如 GkOYE 中的 Y169）先攫取 α -氢，随后 β -氢负离子转移至氧化态黄素（FMN），生成烯酮产物与还原态黄素（FMN hq ），有氧条件下 FMN hq 被 O₂重新氧化完成循环，随后该课题组通过酶工程手段，成功构建起一种能同时控制位点选择性与立体选择性的羰基化合物去饱和化平台（Nat. Chem .2026, 18 , 731-740）。ERED 在光照条件下还可以参与自由基化学，包括催化自由基对α,β-不饱和羰基化合物的Giese型加成。基于这两类看似独立的反应模式，作者提出将酶催化脱氢与光诱导自由基加成融合来实现独特β-C(sp³)–H烷基化反应：首先利用 ERED 对饱和酮进行位点选择性脱氢，在活性位点内原位产生烯酮；随后，还原态黄素通过单电子转移（SET）还原烷基自由基前体，形成的烷基自由基再对烯酮发生 Giese 加成，从而直接完成β-烷基化。

这一设计的特殊之处在于，同一种 ERED 需要实现两种截然不同的催化模式：一方面通过极性双电子过程完成脱氢，另一方面又需要在光照条件下利用单电子过程驱动自由基反应（图1F）。

图1. 环戊酮位点选择性β-烷基化的研究背景和反应设计（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

条件优化：作者首先以 2-苯基环戊酮（1a）和 2-溴乙酰胺（2a）作为模型底物，对一系列结构不同的ERED进行了筛选。反应在Tris缓冲液（100 mM，pH 9.0）、5% DMSO 中进行，并使用 455 nm 光照。不同酶表现出明显不同的催化能力：OYE1 几乎没有活性，而此前在脱氢反应中表现较好GsOYE和GkOYE系列整体显示出更高的转化效率。其中GsOYE-F233L和GkOYE-C26S均可达到 99% 的测定收率，GsOYE-F233L在0.1 mmol规模反应中还获得了95%的分离收率。相比之下，以游离FMN和牛血清白蛋白替代ERED时没有观察到目标产物，支持特定酶环境对反应的重要性。所有情况下3a均为单一异构体，这归因于脱氢步骤专一性地生成热力学更有利的共轭烯酮中间体；又因苯基取代的α-位在反应条件下快速外消旋化，3a以优异的非对映选择性（trans:cis > 20:1）生成。作者也坦承，尽管进行了大量蛋白质工程尝试（见 SI Part VIII），仅在个别案例中实现了高对映选择性（27% 收率，96:4 er），未能发展出普适的不对称方法，这与"ERED 光生物催化中分子间自由基C–C成键的立体控制"这一普遍性难题一致；但该平台的意义超越了立体控制本身，因为它实现了一个此前没有任何催化对应物的全新转化。

表1. 烯还原酶筛选及反应选择性（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

底物拓展：随后，作者分别考察了羰基底物和自由基前体的适用范围。环戊酮侧的底物谱（图2）显示：α-苯基上各类取代基（3b–3o）、α-杂环取代基兼容性较好，包括噻吩（3p）、未保护吲哚（3q、3r）与吡啶（3s）；α-烷基取代基如苄基（3t）与乙基（3u）同样兼容。

图2. 环戊酮底物适用范围（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

尤为值得一提的是，那些在常规 1,4-加成中易受碱或亲核试剂干扰的敏感官能团，如羟甲基（3j）、吲哚N–H（3q、3r）、Weinreb 酰胺（3m）与内酯（3n），这些底物在酶促条件下均兼容较好。与之形成鲜明对比的是，母体环戊酮与α-酯取代的类似物（这两类在小分子催化中通常反应良好）在此却转化很差，凸显了该酶促体系正交的反应性。取代环己酮的反应性普遍低于相应环戊酮，这与其在初始 ERED 脱氢步骤中效率较低相一致；经进一步酶筛选，3w与3x仍以可用收率与优异非对映选择性获得。

自由基前体侧（图3）：除多种溴酰胺给出4a–4d外，2-溴苯乙酮（4e）与2-溴乙酸酯（4f）亦可兼容；使用Ru(bpy)₃Cl₂作为光催化剂时，可由溴甲基吡啶高效引入β-吡啶甲基（4g、4h）；以烷基吡啶鎓（Katritzky）盐为自由基前体，一系列苄基片段也成功偶联到1a（4i–4l）及代表性取代环戊酮（4m–4p）上。

图3. 烷基自由基前体适用范围（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

位点调控与合成应用：在证明该反应具有较好的底物普适性后，作者进一步考察了更具挑战性的位点发散性烷基化。为此，作者选择同时带有α-甲基和α-苯基的环戊酮1v，使两侧β位形成直接竞争。GsOYE-F233L在455 nm光照下优先修饰邻甲基的β位，得到5a，收率32%；改用NCR-W100F并避光后，反应转向邻苯基的β位，得到5b，收率23%。两者rr均大于20:1，由此，仅通过改变酶催化剂与光照条件，即可实现 位点发散性烷基化β-烷基化（图4A）。

图4. 位点分化β-烷基化和生物活性分子合成（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者还展示了该方法在复杂分子合成中的应用，以 Pd 催化α-芳基化制备的底物1a出发，将ERED 催化的β-烷基化与酮还原酶（KRED）催化的不对称羰基还原相串联，通过简短的两步一锅法获得了生物活性分子 6 的四个非对映异构体：采用EbSDR8时，两种异构体的两步总分离收率分别为38%和32%，er为99:1和大于99:1；改用CgKR1-F92C-F94W后，另外两种异构体分别以36%和33%的收率获得，er均为98:2。四者dr均大于20:1（图4B）。这充分展示了该平台在快速构建立体化学多样性分子库、精简复杂分子合成中的价值。

机理研究：为验证所提出的“脱氢–自由基加成”级联机制，作者首先将两个关键步骤开研究：在有氧条件下，GsOYE-F233L 催化1a的位点选择性脱氢，以96% 收率与优异区域选择性给出共轭烯酮7a；再将7a与2a反应，在光照及酶促还原体系存在下，以51%的收率得到目标产物3a。这两个独立实验表明，烯酮作为级联反应中间体与实验结果一致。

图5. 反应机理验证和位点选择性研究（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

自由基捕获实验给出了另一组证据。加入TEMPO后，目标产物收率降至52%，同时得到40%收率的捕获加合物，并由高分辨质谱检出另一种加合物。捕获产物的出现支持碳自由基参与反应，而不仅是观察到添加剂抑制了催化（图5B）。更深入的机理实验揭示，位点选择性可以在不同阶段形成：GsOYE-F233L 促进甲基取代位点的选择性脱氢（图5C），以 61%收率，>20:1 rr 生成7b，其在光照下与2a的Giese加成顺利进行并以单一异构体给出5a。NCR-W100F则先生成近1:1的7b和7c，第一步没有明显位点偏好。但在净还原条件下、黑暗环境的独立验证中，7b以98%收率被还原回1v；7c能够生成5b，收率11%，同时有67%生成1v。此外，该酶还能促使7b向转化，得到72%的7c（图5D）。

本研究建立了一种ERED催化的直接β-烷基化方法，使α-芳基和α-烷基取代环戊酮能够在氧化还原中性条件下实现高位点选择性的C–C键构建。该方法可以利用烷基溴化物以及 Katritzky 盐等常见自由基前体，并表现出较宽的底物范围和良好的官能团兼容性。从催化设计角度看，这项工作将 ERED 的脱氢活性与光诱导自由基反应性整合到了同一个催化体系中，展示了天然酶功能重塑所能提供的催化空间：同一个酶活性位点可以协调传统上属于不同反应模式的极性与自由基过程，并借助酶特有的位点识别能力解决小分子催化中难以处理的选择性问题。这也为利用 ERED及其他氧化还原酶发展更加复杂的非天然级联反应提供了新的思路。

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