北京大学刘涛教授/浙江大学顾臻教授合作，最新Nature Materials！

从聚合物到“分子开关”：新型掩蔽型AAV让基因治疗精准可控

腺相关病毒（AAV）是体内基因治疗和基因编辑中广泛使用的载体，但全身给药后如何实现对特定组织的靶向转导仍是一项重大挑战。衣壳定向进化和AAV文库筛选虽可在模型系统中获得具有期望组织趋向性的变体，却常因物种特异性受体相互作用而难以转化至灵长类和人；利用细胞穿透肽、纳米抗体、适配体或RGD基序的配体导向衣壳工程可将AAV转导偏向受体表达组织，但天然趋向性通常未被消除；聚合物和纳米颗粒策略，包括两性离子肽修饰、聚乙烯亚胺包被和水凝胶包埋，已被探索用于调节AAV递送并改善对选定组织或疾病部位的定位，但往往受限于复合物不稳定性、感染力下降和聚合物相关毒性。这些局限凸显了对跨物种、向期望位置实现特异性AAV介导基因递送的迫切需求。

针对这一难题，北京大学刘涛教授、浙江大学顾臻教授合作开发了一种掩蔽型AAV策略，通过在内源和外源触发信号下实现精准可控的基因递送。该研究将含四嗪基团的非天然氨基酸mPTet位点特异性引入AAV衣壳蛋白，使其高效偶联反式环辛烯修饰的截短AAV受体或聚乙二醇，从而在小鼠体内完全阻断病毒感染力（图1a）。三种不同的可切割连接子使掩蔽基团能够通过肝脏特异性蛋白酶matriptase-2、近红外光（NIR）或炎症相关活性氧（ROS）选择性去除，从而恢复AAV感染力，在全身给药后实现向肝脏、脑、肌肉和心肌的组织特异性基因递送。在心肌缺血再灌注损伤模型中，静脉注射ROS激活的掩蔽型AAV实现了向受损心肌的靶向基因递送，导致VEGF-A165的局部表达并促进心肌修复。相关论文以“Controllable gene delivery via masked adeno-associated viral vectors”为题，发表在Nature Materials上。

研究人员首先在AAV-DJ衣壳的亮氨酸S85（LS85）位点引入mPTet，通过四嗪-TCO点击化学偶联PEG掩蔽基团（图1b,c）。Western blot和透射电镜证实，mPTet引入未扰动衣壳组装，突变载体体外转导活性与野生型相当。四嗪-TCO化学比叠氮-DBCO化学更高效，PEG20K修饰的AAV-DJmPTet在体外和体内均几乎检测不到转导，与背景水平相当（图1d,e）。受前药设计启发，研究人员还以AAV受体（AAVR）的细胞外多囊肾病结构域1和2（PKD1,2）作为截短受体衍生的掩蔽基团（图1f），同样有效阻断了肝脏转导（图1g–i）。

图1 | 位点特异性PEG化和AAVR掩蔽有效阻断AAV感染力。

在此基础上，研究人员设计了MT2蛋白酶激活的掩蔽型AAV（图2a）。通过融合不同重复数的MT2可切割连接子和XTEN至hPKD1,2结构域C端，构建了多种变体（图2b）。体外实验显示，MT2蛋白酶预处理可恢复特定变体的转导能力（图2c）。体内生物发光成像和肝脏信号定量表明，静脉注射后v1变体在肝脏中表现出显著激活（图2d,e）。该策略进一步扩展至AAV8血清型（图2f），AAV8-PKDMT2实现了选择性肝脏转导（图2h–j），肝脏与心脏信号比值显著优于未掩蔽载体（图2k）。

图2 | MT2激活的掩蔽型AAV的设计及体内选择性肝脏转导的表征。

在NIR光激活方面，研究人员设计了TCO-NIR-PEG20K掩蔽基团，其可在690 nm近红外光下发生光氧化切割，随后经水解/环化释放PEG并恢复AAV感染力（图3a,b）。体外实验显示，无光照时AAV-DJ-PEGNR转导被完全阻断，照射后呈光依赖性恢复（图3c,d）。小鼠腓肠肌注射后局部NIR照射，25 J诱导114倍增强，100 J恢复至297倍（图3e,f）。AAV9-PEGNR立体定向注射至脑部后局部照射，荧光素酶表达增加73.6倍，达到AAV9mPTet转导效率的56.1%（图3g,h）。系统给予AAV9-PEGNR后，照射区域荧光素酶表达较非照射对照增加5,799倍（图4a,b），且离体成像证实脱靶转导显著减少（图4c,d），照射区域转基因表达可维持长达60天。

图3 | NIR激活的掩蔽型AAV的设计及体内NIR控制基因转导的表征。

针对脑靶向递送，研究人员将掩蔽策略应用于AAV-PHP.EB，在HS84位点引入mPTet并偶联TCO-NIR-PEG20K。Ly6a高表达脑微血管内皮细胞实验显示，PEG化阻断病毒附着，NIR照射后恢复。Transwell血脑屏障模型验证了光控跨内皮运输。体内实验中，局部脑照射使荧光素酶表达较非照射对照增加134倍（图4e,f），AAV-PHP.EB-PEGNR实现了脑特异性转导，脑肝信号比从PHP.EB的约3提高至100.6（图4g,h）。

图4 | 静脉注射NIR激活的掩蔽型AAV实现肌肉和脑中的特异性基因递送。

在病理ROS作为内源触发信号方面，研究人员将mPTet引入的sfGFP偶联TCO-BR-PEG20K（图5a），证实150 μM H2O2可诱导PEG几乎完全切割，60分钟内释放约70%的sfGFP（图5b）。AAV-DJ-PEGBR在HEK293T细胞中表现出ROS依赖性转导恢复（图5c,d）。在CCl4诱导的肝纤维化模型中，静脉注射AAV-DJ-PEGBR后纤维化小鼠肝脏荧光素酶信号增加57倍，而健康小鼠信号可忽略（图5e,f）；离体成像证实转基因表达局限于肝脏，而AAV-DJmPTet在心脏中广泛转导（图5g,h）。

图5 | ROS激活的掩蔽型AAV的设计及肝纤维化模型中受控基因转导的评估。

在心肌I/R损伤模型中，研究人员筛选出H584为AAV9的最佳mPTet引入位点，生成ROS响应载体AAV9-PEG。系统给药后，AAV9-PEG在I/R心脏中诱导稳健且局部的荧光素酶表达，心脏靶向效率达95.9%，显著高于AAV9mPTet的63.5%。进一步将VEGF-A165包装至AAV9-PEG中，再灌注后2小时静脉给药，超声心动图显示治疗小鼠射血分数和缩短分数改善，左心室舒张末期内径更小，梗死面积和纤维化面积减少，血清乳酸脱氢酶水平降低，心肌VEGF-A表达增加，表明掩蔽型AAV递送VEGF-A165可恢复心肌功能。

药代动力学和免疫原性评估显示，非可切割掩蔽载体的AUC-24h较未修饰AAV高24至29倍，可切割掩蔽载体保持相似的终末消除半衰期。AAV9-PEG诱导的抗AAV IgG和中和抗体水平低于AAV9mPTet，基于PKD的内源蛋白衍生掩蔽模块进一步降低了抗体反应。掩蔽型AAV在IVIg实验和NAb阳性小鼠中表现出部分抗中和能力，且未引起可检测的组织学异常或血清生化毒性。

总之，该研究通过非天然氨基酸引入和超快四嗪-TCO生物正交化学，将掩蔽基团（蛋白质或聚合物）位点特异性偶联至AAV衣壳，阻断受体结合并使病毒失活；通过蛋白酶、ROS或NIR光选择性切割连接子，恢复载体感染力，实现向特定组织的可控基因递送。该策略可适应多种AAV血清型，包括AAV-DJ、AAV8、AAV9和AAV-PHP.eB，修饰位点由结构或基于AlphaFold的设计指导，模块化结构允许掩蔽基团和响应连接子互换。尽管NIR激活在深部人体组织中可能受光穿透限制，但可植入光纤或其他微创光学接口可扩展其转化应用。未来针对疾病相关或外部触发信号（如缺氧、一氧化氮、pH、X射线或超声）的生物相容性化学，有望进一步扩展掩蔽型AAV及相关蛋白质递送平台。