经典复方1区top！广州中医药大学揭示五苓散激活S1PR2/GPX4轴抑制铁死亡改善顺铂诱导的急性肾损伤

PART 01

写在前面

急性肾损伤（AKI）是临床危重综合征，住院患者中发病率约7-18%，ICU中高达50%，目前缺乏有效的 curative therapy。
肾小管上皮细胞死亡是AKI进展的核心事件，其中铁死亡（ferroptosis）扮演关键角色。
近日，一篇发表于Phytomedicine的研究揭示：经典利水方五苓散（WLS），可通过上调S1P水平、激活S1PR2/GPX4轴、促进S1PR2与GPX4的物理互作，从而抑制铁死亡、减轻炎症、改善肾功能，为AKI治疗提供了新靶点。

题目及作者信息

文献概述：一张图读懂核心发现

PART 02

研究背景

AKI是重大临床挑战：约7-18%住院患者受累，ICU中高达50%，10-15%需要肾脏替代治疗，预后差。病理机制涉及线粒体功能障碍、氧化应激、内质网应激等，最终导致肾小管损伤、炎症和调节性细胞死亡。

铁死亡是AKI的关键驱动因素：铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡。GPX4是核心防御分子，利用还原型GSH解毒脂质过氧化物。近期研究揭示了GPX4稳定性的调控网络，但上游信号通路仍 largely elusive。

S1P/S1PRs信号在肾脏疾病中作用显著：S1P是鞘脂衍生的多效性脂质介质，通过五种G蛋白偶联受体（S1PR1-5）发挥多种病理生理调节作用。S1PR1激动剂FTY720在顺铂和IRI模型中减轻肾损伤和炎症；S1PR3拮抗减轻脓毒症AKI。S1PR2亚型近期受到关注，但在肾小管上皮细胞和顺铂诱导的AKI模型中作用完全未知。S1P/S1PRs是否参与调控铁死亡也尚不清楚。

五苓散是经典肾脏疾病方剂：现代药理研究已证实其利尿、抗炎、免疫调节和肾脏保护特性。课题组前期研究已表明五苓散通过AVPR2/cAMP/PKA/CREB（抑制衰老）和CaSR/CaMKβ/AMPK（抑制凋亡）等多条GPCR通路发挥肾脏保护作用，但S1PR2/GPX4轴是否介导五苓散在顺铂AKI中的抗铁死亡作用尚不清楚。

PART 03

创新性

1. 首次揭示S1PR2在肾小管铁死亡中的关键作用：S1PR2此前在AKI中的研究主要聚焦于微血管和纤维化，本研究首次证明其在肾小管上皮细胞铁死亡中的核心功能。

2. 首次发现S1PR2与GPX4的物理互作：通过Co-IP证实S1PR2与GPX4存在直接相互作用，为S1PR2调控铁死亡提供了分子基础。

3. 构建肾小管特异性S1pr2敲除小鼠：使用Ggt1-Cre×S1pr2^flox/flox系统，在体内严格验证了S1PR2对五苓散抗铁死亡效应的必要性，证据等级高。

4. 多维度验证策略：从整体动物 → 组织病理 → 细胞模型 → 分子互作 → 基因敲除，层层递进，逻辑严密。

5. 中药复方多靶点机制的精细解析：五苓散仅5味药，但研究揭示了其通过SphK2→S1P→S1PR2→GPX4的精细信号级联，体现了中药复方“多成分-多靶点-多通路”的特点。

6. 网络药理学与实验验证互补：虽然S1PR2未被网络药理学预测到，但实验验证明确证实了其功能重要性，体现了计算预测与实验验证的互补价值。

PART 04

研究思路

化学成分分析

• UPLC-Q-TOF/MS：鉴定五苓散中40种化学成分。

• UPLC-DAD：定量分析肉桂醛（桂皮醛）含量，建立指纹图谱。

动物实验

1. 模型：雄性C57BL/6J小鼠，顺铂（20 mg/kg，单次腹腔注射）诱导AKI。五苓散预处理7天（低剂量2.34 g/kg、中剂量4.68 g/kg、高剂量9.36 g/kg），第7天注射顺铂，72小时后取材。

2. 肾小管特异性S1pr2敲除小鼠：Ggt1-Cre⁺S1pr2^flox/flox（S1pr2^CKO）和Ggt1-Cre⁻S1pr2^flox/flox（S1pr2^WT），分为对照组、模型组和五苓散组（9.36 g/kg）。

3. 检测指标：

• 肾功能：血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）。

• 组织病理：H&E染色、TUNEL染色。

• 炎症因子：Il6、Il1b、Tnf、Ccl2 mRNA。

• 铁死亡标志物：GSH、SOD、MDA、Fe²⁺、4-HNE、p53、SLC7A11、GPX4、ACSL4。

• S1P/S1PR2通路：S1pr1-5 mRNA、S1PR2蛋白、S1P水平、SphK2/SGPL1 mRNA、GTP-RhoA。

• Co-IP：S1PR2与GPX4的物理互作。

细胞实验

1. mRTECs：顺铂（5 μM）诱导损伤，五苓散含药血清（2.5%、5%、10%）预处理。

2. 检测：细胞活力（CCK-8）、铁死亡相关蛋白（ACSL4、SLC7A11、GPX4）、脂质ROS（BODIPY C11流式）、GTP-RhoA。

3. 拮抗剂实验：S1PR2特异性拮抗剂JTE-013（10 nM）。

网络药理学

预测五苓散40种成分的729个靶点与1602个AKI相关基因的交集，构建PPI网络，KEGG富集分析。

PART 05

研究结果

图1：五苓散的化学图谱

这张图展示了五苓散的化学物质基础。(A-B) UPLC-Q-TOF/MS正负离子模式基峰图，共鉴定40种成分，归属为三萜类、倍半萜类、苯丙素类、甾体、有机酸等七大类。其中包含多种已知肾保护活性成分：泽泻醇B 23-乙酸酯、白术内酯I、肉桂醛、茯苓酸A等。(C) UPLC-DAD在203 nm下的代表性色谱图，肉桂醛（峰11）占总峰面积的42.61%。(D) 三维UPLC-DAD色谱图（203、245、270、286 nm）。肉桂醛平均含量3.02 mg/g，精密度RSD 0.23%，24h稳定性RSD 0.09%，重复性RSD 0.30%。

图2：五苓散减轻AKI小鼠肾损伤

这张图展示了五苓散的整体药效。(A) 动物实验流程图：连续灌胃10天，第7天单次注射顺铂。(B-C) SCr和BUN：模型组显著升高，五苓散剂量依赖性降低。(D-E) 肾损伤标志物Havcr1和Lcn2 mRNA：模型组升高，五苓散降低。(F-G) H&E染色：模型组肾小管上皮细胞空泡化、管腔扩张、刷状缘丢失、蛋白管型；五苓散改善。(H-K) 炎症因子Il6、Il1b、Tnf、Ccl2 mRNA：模型组升高，五苓散抑制。(L-M) TUNEL染色：模型组肾小管细胞死亡增加，五苓散抑制。这表明五苓散改善肾功能、减轻组织病理损伤、抑制炎症和细胞死亡。

图3：五苓散增强抗氧化能力并抑制AKI小鼠铁死亡

这张图展示了五苓散对铁死亡的抑制作用。(A-D) GSH、SOD、MDA、Fe²⁺：模型组GSH和SOD降低、MDA和Fe²⁺升高；五苓散逆转。(E-I) IHC：模型组4-HNE（脂质过氧化标志物）升高、p53升高、SLC7A11和GPX4降低；五苓散下调4-HNE和p53，上调SLC7A11和GPX4。(J-M) Western blot：模型组ACSL4升高、SLC7A11和GPX4降低；五苓散逆转。这表明五苓散有效抑制顺铂AKI中的铁死亡通路。

图4：五苓散含药血清抑制体外顺铂诱导的铁死亡

这张图在细胞水平验证了五苓散的抗铁死亡作用。(A-B) CCK-8：确定顺铂5 μM诱导损伤，五苓散含药血清2.5%、5%、10%用于后续实验。(C-F) Western blot：顺铂增加ACSL4、降低SLC7A11和GPX4；五苓散含药血清逆转。(G-H) 脂质ROS流式：顺铂增加脂质ROS，五苓散含药血清降低。这表明五苓散含药血清减轻顺铂诱导的氧化应激并抑制mRTECs铁死亡。

图5：五苓散对AKI小鼠S1P/S1PR2/GPX4轴的调控

这张图揭示了五苓散作用的关键通路。(A-B) S1prs mRNA：模型组S1pr1、S1pr2、S1pr4改变，五苓散选择性下调S1pr2（注意mRNA下调但蛋白上调，提示转录后调控）。(C-F) Western blot：顺铂降低S1PR2蛋白，五苓散和含药血清逆转。(G-H) IHC：S1PR2主要表达于肾小管上皮细胞，五苓散上调。(I-J) S1P水平：五苓散升高S1P。(K-L) SphK2 mRNA：模型组降低，五苓散恢复；Sgpl1 mRNA各组无差异，提示五苓散主要通过上调SphK2（合成酶）而非抑制SGPL1（降解酶）来升高S1P。(M-N) GTP-RhoA：顺铂降低GTP-RhoA（S1PR2下游活性形式），五苓散恢复，JTE-013（S1PR2拮抗剂）阻断。(O) Co-IP：S1PR2与GPX4存在物理互作。(P-T) 网络药理学分析。这证明五苓散通过SphK2介导的S1P产生激活S1PR2信号，且S1PR2与GPX4存在物理互作。

图6：肾小管特异性S1pr2敲除阻断五苓散的肾脏保护作用

这张图通过基因敲除验证了S1PR2的功能必要性。(A) 基因型鉴定：成功构建S1pr2^CKO小鼠。(B-F) IHC和Western blot：S1pr2^CKO小鼠肾小管S1PR2显著降低，其他家族成员mRNA不受影响。(G-H) SCr和BUN：S1pr2^CKO小鼠在模型组和五苓散治疗组均升高。(I-J) H&E染色：S1pr2^CKO加剧肾小管损伤（蛋白管型、空泡化），消除五苓散治疗效应。(K-P) 肾损伤标志物和炎症因子mRNA：S1pr2^CKO升高。(Q-R) TUNEL：S1pr2^CKO加剧肾细胞死亡。这表明肾小管S1pr2缺失加剧肾损伤和炎症反应，消除五苓散的肾脏保护作用。

图7：肾小管特异性S1pr2敲除阻断五苓散对铁死亡的抑制作用

这张图从铁死亡角度验证了S1PR2的必要性。(A-D) GSH、SOD、MDA、Fe²⁺：S1pr2^CKO加剧氧化应激和铁过载，减弱五苓散疗效。(E-G) Western blot：S1pr2^CKO加剧铁死亡，消除五苓散抗铁死亡作用。这证明五苓散通过S1PR2/GPX4轴抑制铁死亡改善AKI，肾小管S1pr2是损伤严重程度和治疗反应的关键决定因素。

PART 06

结论

五苓散（WLS）通过以下机制改善顺铂诱导的AKI：

• 改善肾功能：降低SCr和BUN，减轻组织病理损伤。

• 抑制炎症：降低Il6、Il1b、Tnf、Ccl2等促炎因子。

• 抑制铁死亡：

• 恢复GSH和SOD，降低MDA和Fe²⁺。

• 下调4-HNE和p53，上调SLC7A11和GPX4，下调ACSL4。

• 减少脂质ROS积累。

• 激活S1P/S1PR2/GPX4轴：

• 上调SphK2表达，增加S1P合成。

• 上调S1PR2蛋白表达（尽管mRNA下调，提示转录后调控）。

• 恢复GTP-RhoA活性（S1PR2下游信号）。

• 促进S1PR2与GPX4的物理互作。

• 肾小管S1pr2是功能必需的：肾小管特异性S1pr2敲除加剧肾损伤、炎症和铁死亡，基本消除五苓散的肾脏保护作用。

核心机制：五苓散通过SphK2介导的S1P合成增加 → 激活S1PR2 → 促进S1PR2与GPX4互作 → 稳定GPX4 → 抑制脂质过氧化和铁死亡，从而减轻AKI。

PART 07

参考文献

Xiong J, Long Z, Ma J, Jiang H, Ye J, Zeng Z, Liao Y, Lao B, Zhou Y, Yu Y, Zhou J. Wuling powder alleviates acute kidney injury by regulating S1PR2/GPX4 axis to inhibit ferroptosis. Phytomedicine. 2026 Sep 11;162:158801.

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PART 08

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