北京大学AM：可注射双层水凝胶实现牙周软硬组织一体化再生

牙周炎作为全球第六大常见疾病，不仅导致牙齿脱落，还与心血管疾病、糖尿病及不良妊娠结局等全身性疾病密切相关。据统计，全球因牙周炎导致的伤残调整生命年高达690万，生产力损失达821亿美元，给全球健康与经济带来沉重负担。牙周组织是一种独特的矿化与非矿化组织分级复合体，依赖有序排列的牙周韧带将牙齿锚定于牙槽骨中，维持牙齿稳定。然而，理想的牙周再生需要同时恢复牙槽骨和排列良好的牙周韧带，其复杂的空间结构与时空功能调控成为当前主要难点。目前，引导组织再生（GTR）和骨移植仍是主流临床方法，但GTR膜存在固定困难、吸收与再生速率不匹配、生物活性弱及结构简单等局限，骨移植材料则降解过慢且缺乏骨诱导性。组织工程策略虽被视为更优替代方案，但主要依赖单层均质支架，缺乏多种结构/生化指令信号的整合，难以诱导协调的牙周再生。分级支架在皮肤、骨软骨及牙周等分级组织再生中展现出优越潜力，但传统分级异质结构常因缺乏跨界面聚合物链渗透而存在界面结合薄弱问题，易在外部载荷下产生局部应力集中，导致界面分层与开裂，同时有限的湿粘附性也影响其在湿润骨与牙表面的稳定性。因此，亟需一种可原位注射、层间结合、湿粘附的分级支架。

针对这一挑战，北京大学口腔医院王晓燕‌主任医师、韩冰副教授合作，开发了一种同步原位共注射、层间结合、湿粘附的双层水凝胶（Bio-Fun双层水凝胶），由PCAC和PCMC两层组成。该研究通过聚合物链拓扑缠结以及动态硼酸酯键和离子网络构建了抗分层界面，并通过精确的复合粘度匹配实现了同步微尺度层流共挤出。同时，该水凝胶保持湿粘附性能，尤其对湿润的牙根和骨表面具有良好粘附力。在时空生物功能化方面，PCAC层负载microRNA-26a脂质体以激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨，PCMC层共价连接PDGF-BB模拟肽以触发PI3K/Akt-LOX信号通路，促进成纤维细胞募集和功能性胶原形成。体内实验表明，Bio-Fun双层水凝胶实现了牙槽骨和排列整齐的牙周韧带纤维的整合再生，形成了类似Sharpey纤维的结构，使骨-韧带附着牢固。这种模块化、可注射的设计可能为牙周、骨软骨及其他软硬组织界面的重建提供广泛参考。相关论文以“A Tightly Interlayer Bonded, Synchronously In Situ Co-Injectable, Wet-Adhesive, Hierarchically Biofunctionalized Bilayer Hydrogel for Functional Attachment and Orderly Periodontal Regeneration”为题，发表在Advanced Materials上。

示意图1 | 用于功能性附着和有序整合牙周再生的原位可注射、分级生物功能化、湿粘附双层水凝胶（Bio-Fun双层）的示意图。（A）可注射双层水凝胶的制备和分级生物功能化。（B）Bio-Fun双层水凝胶修复牙周缺损及其层间结合和湿粘附原理，以及促进牙槽骨和牙周韧带再生的机制。

研究人员首先对双层水凝胶的制备与表征进行了系统研究。为应对牙周再生挑战并模拟牙周组织的分级结构，他们基于马来酰亚胺修饰和未修饰的海藻酸钠开发了双层水凝胶系统（图1a）。通过EDC/NHS活化，海藻酸钠与马来酰亚胺盐酸盐反应成功实现了Alg-MAL的修饰，FTIR和¹H NMR结果均证实了修饰的成功（图1b、图1c）。扫描电镜和原子力显微镜显示PCAC和PCMC具有相似的内部多孔结构和表面形貌（图1e、图1f），这种微纳尺度特征有利于营养扩散和细胞浸润。力学测试表明，马来酰亚胺功能化增强了材料刚度，PCMC的压缩和拉伸模量分别为22.28±5.48 kPa和43.90±4.08 kPa，而PCAC则为12.74±0.63 kPa和17.96±0.53 kPa（图1g、图1h）。这种梯度状力学特征为细胞组织和功能组织重建提供了空间定义的线索。流变学测试确认了水凝胶的稳定形成，PCAC和PCMC的储能模量G'始终高于损耗模量G''（图1i、图1j）。两种水凝胶均表现出低溶胀（低于30%）和缓慢降解（21天后保留约50%质量）的特性，与组织再生时间尺度一致。尽管PCAC和PCMC的线性粘弹区存在差异，但在LVR内的剪切模量和复合粘度相当接近，因此通过双筒注射器套件实现了PCAC和PCMC层的无缝共挤出（图1m），形成了机械稳健的双层结构而无分层现象（图1n）。

图1 | 具有独特性质的可注射湿粘附双层水凝胶的制备与表征。

在湿粘附性能和层间整合方面，研究人员通过搭接剪切测试量化了PCAC和PCMC水凝胶在皮肤、粘膜、骨和牙表面的粘附强度（图2b），结果显示在猪皮肤上的粘附强度约为40 kPa。双层水凝胶的最大拉伸力记录为1.61 N，介于PCMC单层（2.1 N）和PCAC单层（1.4 N）之间。力-位移曲线在整个测试过程中保持平滑，没有出现表明界面分层的突然下降（图2g）。在降解过程中，两层水凝胶始终保持牢固整合，未观察到明显的界面分层或分离。这些结果充分表明，界面结合强度超过了水凝胶本体的内聚强度，证实界面并非机械薄弱点，这种在剥离载荷下的稳健结构完整性为牙周再生过程中软硬组织界面的稳定整合提供了可靠的机械支撑。

图2 | PCAC和PCMC水凝胶的湿粘附性能与层间整合。

在时空生物功能化方面，研究人员进一步实现了双层水凝胶的分级生物功能化，以实现对牙槽骨和牙周韧带再生的靶向时空调控（图3a）。透射电镜和扫描电镜图像显示，脂质体呈现均匀的双层球形形态，平均直径约100 nm（图3b）。Zeta电位分析表明，游离miR26a带负电，而空白脂质体显示正表面电位，负载miR26a后脂质体仍保持阳离子电位（图3d），有利于增强细胞摄取。FAM-miR26a摄取实验证实，游离miR26a内化极少，而脂质体包裹的FAM-miR26a则产生强烈的细胞内荧光（图3e）。miRNA封装效率计算为78.78%±0.82%。对于多肽，研究人员使用GSH作为PDGF-BB模拟肽的替代物，通过硫醇-烯点击化学共价连接到Alg-MAL上（图3f），FTIR光谱证实了成功结合（图3g）。释放实验表明，包裹miR26a的阳离子脂质体通过静电吸附到带负电的水凝胶基质上，实现了缓慢而持续的释放（图3h）；而共价连接的PCMC@PDGF组则遵循一级平台模型，约75%的肽保持锚定，用于侵蚀依赖的长期释放（图3i）。荧光图像展示了双层水凝胶中生物活性剂的分级生物功能化封装（图3j）。

图3 | 可注射双层（Bio-Fun双层）水凝胶的分级生物功能化。

在体外成骨评价中，研究人员利用hBMSCs评估了PCAC@Lipo-miR26a的细胞相容性与成骨活性。CCK-8和Live/Dead实验显示水凝胶具有良好的细胞相容性（图4a、图4b）。碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色表明，PCAC@Lipo-miR26a组显著促进了hBMSCs的成骨分化与矿化（图4c、图4d）。RT-qPCR结果显示，miR26a的3D水凝胶递送显著上调了RUNX2和OPN等成骨相关标志物的表达（图4e、图4f），而游离miR26a和未结合水凝胶的Lipo-miR26a则表现出明显的突释特征。这些结果说明，PCAC@Lipo-miR26a水凝胶能够为hBMSCs提供持续的成骨信号，促进其向成骨方向分化。

图4 | PCAC@Lipo-miR26a水凝胶的体外成骨评价。

在体外生物学评价中，研究人员评估了PCMC@PDGF肽水凝胶对hPDLCs增殖、迁移和纤维形成分化的影响（图5a）。Transwell实验和划痕实验表明，PDGF-BB模拟肽显著促进了hPDLCs的趋化迁移和增殖（图5b、图5c、图5d）。活/死染色显示各组细胞活力良好（图5g）。3D水凝胶迁移实验表明，PCMC@PDGF肽水凝胶中的细胞迁移深度最大（图5h、图5i）。RT-qPCR和免疫荧光分析显示，PCMC@PDGF肽水凝胶显著上调了牙周韧带相关标志物（如POSTN、TNC、TNN、PLAP1）的表达（图5j、图5k、图5l、图5m、图5n）。这些结果表明，PCMC@PDGF肽水凝胶为软牙周组织再生提供了有利的微环境，具有趋化招募牙周韧带细胞到牙根表面的巨大潜力。

图5 | PCMC@PDGF肽水凝胶对hPDLCs增殖、迁移和纤维形成分化的影响。

在体内牙周再生评价中，研究人员在大鼠牙周缺损模型中评估了Bio-Fun双层水凝胶介导的牙槽骨和牙周韧带协同再生（图6a）。Micro-CT分析表明，Bio-Fun双层水凝胶实现了最广泛和连续的牙槽骨再生，显著优于单层、空白双层和对照组（图6b、图6c、图6d、图6e）。组织学检查显示，Bio-Fun双层水凝胶不仅促进了稳健的骨形成，还促进了排列良好的PDL样胶原纤维和丰富的新血管形成，与天然牙周结构特征高度相似（图6f、图6g）。Masson染色和Sirius Red染色进一步证实，仅在双层组中鉴定出明显的Sharpey纤维，一端嵌入牙根表面新形成的牙骨质中，另一端锚定在再生的牙槽骨内（图7a），表明再生基质稳定而牢固的整合。胶原纤维取向分析显示，只有天然牙周韧带和Bio-Fun双层组表现出纤维排列角度的单峰分布（图7f、图7m），表明双层设计不仅促进胶原合成，还协调其空间组织，从而在形态、排列、组成和功能附着方面实现牙周韧带的仿生再生。

图6 | 大鼠牙周缺损体内牙周复合体整合再生。

图7 | 体内牙周韧带纤维的功能性附着和有序排列。

在机制研究方面，研究人员探讨了PCAC@Lipo-miR26a水凝胶促进成骨的机制（图8a）。RT-qPCR结果显示，基于3D水凝胶的miR26a递送导致GSK-3β表达下降、β-catenin上调，随后激活Wnt信号通路（图8b、图8c）。免疫荧光染色在蛋白质水平验证了这些结果（图8d）。体内免疫荧光染色显示，PCAC@Lipo-miR26a、单层和Bio-Fun双层组中RUNX2和β-catenin的表达水平显著升高（图8e、图8f、图8g），且Bio-Fun双层组的共定位最佳（图8h）。对于PCMC@PDGF肽水凝胶促进牙周韧带再生的机制，转录组测序分析显示，肽处理后187个基因下调、160个基因上调（图9a）。聚类分析（图9b）、GO分析（图9c）和KEGG通路富集分析（图9d）表明，PDGF-BB模拟肽参与细胞迁移、生长和凋亡调控等多个生物学过程，且PI3K/Akt信号通路、ECM-受体相互作用、粘着斑和肌动蛋白细胞骨架调控在治疗组中显著富集。体外RT-qPCR验证了PCMC@PDGF肽水凝胶中hPDLCs的PI3K/Akt通路激活（图9e、图9f），LOX、FGF和POSTN等与软组织和胶原纤维再生相关的基因上调（图9g），LOX表达上调经RT-qPCR和免疫荧光染色证实（图9h、图9i、图9j）。体内免疫荧光染色显示，Bio-Fun双层组中PI3K和POSTN的表达水平显著高于其他组（图10a、图10b、图10c），LOX和POSTN的表达也显著升高（图10d、图10e、图10f、图10g、图10h）。使用PI3K抑制剂LY294002的反向验证实验进一步证实，PI3K/Akt信号通路的激活在介导PDGF-BB模拟肽诱导的POSTN/LOX信号轴中起关键调控作用（图10i）。

图8 | 体外和体内信号通路及成骨标志物评价。

图9 | PCMC@PDGF肽水凝胶促进牙周韧带再生的转录组测序与机制验证。

图10 | Bio-Fun双层水凝胶促进牙周韧带功能附着和有序再生的机制。

综上所述，该研究开发了一种原位形成、层间结合、湿粘附、时空生物功能化的可注射双层水凝胶系统，能够协同再生牙槽骨和功能性牙周韧带。该水凝胶可原位注射形成分层结构，在模拟复杂分级结构与适应不规则缺损区域之间取得平衡。紧密的层间结合促进了分层组织整合，其湿粘附和低溶胀特性使其在动态湿润口腔条件下与组织紧密接触。双层水凝胶的力学特性经过调控以满足组织再生需求。此外，miR26a和多肽的时空生物功能化为牙周韧带和牙槽骨的细胞调控与组织再生提供了精确而持续的信号。更重要的是，该策略引导了牙周韧带的功能性附着和有序排列，促进了牙周组织重建。这些设计有望为多种分级组织的修复提供有价值的见解。该研究的转化潜力在于平衡通用框架与组织特异性定制：通用方面，原位注射成型、稳定的层间结合和湿粘附有助于在软硬界面（牙周-骨、骨软骨、肌腱-骨）实现无缝机械过渡，抵抗生理冲洗和剪切；可定制方面，其生物活性载荷易于替换，降解动力学可通过交联密度和投料比进行调整以匹配宿主组织，确保广泛的组织工程多功能性。